论文摘要
肝癌是临床常见的实质性恶性肿瘤之一,由于起病隐匿,进展迅速,恶性程度高,易转移复发,生存期短,治疗起来比较困难,为全世界死亡率很高的疾病。据世界卫生组织统计,全球每年约有一百万人死于与肝癌相关的疾病,目前,肝癌的治疗仍以手术为主,40%的肝癌病人,可以从手术治疗中获益,但仍有大部分病人,因身体状况、肝功能、肿瘤部位、大小,肝硬化、严重黄疸或腹水等多种原因而不能手术切除治疗,而以手术切除治疗的病人其复发发率亦约达40%-60%。以侵入性的治疗方法仍未能有效对抗肝癌,现行使用的抗癌化疗药物,皆未能达到预期疗效,同时任何一种放疗、化疗方案都伴有明显的毒副作用,致使许多患者无法坚持而放弃治疗。中医辨证论治在肝癌的治疗中虽具有一定的疗效与独特的优势,但欠缺科学的依据而无法进入现代医学领域相评比的途径。综观近年来的文献资料,中医药对肝癌的治疗,已进行许多实验研究,但现有的实验研究,多偏重于西方医学病理的机转,对中医的临床遣方用药无法起到指导的作用。肝癌的病机及临床表现复杂多变,而辨证论治是中医药的理论核心,因而单按现有的分型方法,不易掌握治则治法,亦不能全面反映肝癌的整个病理变化过程,而且目前尚未建立统一的疗效评定标准,对临床疗效缺乏可比性。如何将中医药治疗作为临床治疗的主要手段之一,使得中西医的互补综合治疗有了更新的深度,亦将是今后临床研究的热点。由于分子生化科技的发展,应用现代科技融入中医药理论,探求中医药的深度是中医临床及科研人员共同努力的方向,因此本研究课题依据中医药的理论及临床体会的经验,结合现代生化科技,按照中医的临床模式应用胞外实验,以MTT还原法和单细胞微流体系统芯片作测试,筛选评估合理的遣方用药,以总结治则治法,作为中医临床治疗肝癌遣方用药的参考与应用,对提升中医治疗肝癌的疗效具有研究意义,为中医药的深度,寻求更精致的科学验证方法。从文献资料的研究,治疗肝癌的中药单方、复方数量不少,但尚缺乏临床比对及科学的验证,大部分均未经现代临床研究方法初步验证。中医认为“热毒”是肿瘤形成的原因之一,临床观察及药理学研究也表明,清热解毒药物具有一定的抗癌活性。因此依据个人临床治疗肝病及肝癌的体验,摒除加拿大卫生部禁止进口使用的中药及环保部门保育类动植物禁用的药材,而选择七种复方,及其中”清肝抗癌方”所组成的单味中药,总共十一种中药样本。分别为柴胡清肝汤（试样A）、加味柴胡清肝汤Ⅰ（试样B）、加味柴胡清肝汤Ⅱ（试样C）、加味柴胡清肝汤Ⅲ（试样D）、茵陈五苓散（试样F）、茵陈蒿汤（试样G）、清肝抗癌方（试样H）、黄水茄（试样J）斑蝥（试样K）、白花蛇舌草（试样L）、金银花（试样M）,加味柴胡清肝汤,为诊所临床治疗乙型肝炎的处方之一。本实验为传统中药方剂的胞外测试.,研究临床中药复方其抗癌活性和对癌细胞代谢的影响。所选用的细胞株为人肝癌细胞株HepG2及人白血病细胞株HL-60,以MT还原法和单细胞微流体系统芯片两个平台作胞外测试,胞外测试结果再与临床观察和中医药理论进行比较。MTT还原法可以测出在不同浓度的中药（TCM）方剂作用下,癌细胞的存活率,亦既待测药物的抗癌活性.。微流体系统芯片首先”固定”单一细胞,并且维持其存活及生理活性,然后容许药物通过芯片固定化的单细胞进行代谢,细胞代谢的检测系针对钙离子浓度变化与细胞生理活性的关连性,透过微流体系统芯片的检测器来进行,该检测器以光学方法检测钙离子浓度的起伏变化,间接检测单一细胞对该待测药物的反应。利用这种微流体芯片,可“实时（real time） "完成对药物的代谢物检测和代谢物的细胞毒性评价。胞外测试结果再依中医药理论筛选有效组方,从组方总结治则治法。根据MTT法检测的结果,中药试样复方：试样B（加味柴胡清肝汤Ⅰ）,试样C（力[味柴胡清肝汤Ⅱ）,试样D（加味柴胡清肝汤Ⅲ）,试样F（茵陈五苓散）,试样H（清肝抗癌方）都有与浓度正相关的抑制HepG2细胞株的趋势,以试样H清肝抗癌方最具统计意义.试样K（斑蝥）是单方中抑制HepG2最有效者,但是单细胞晶片的检测显示,试样K激发的钙离子反应不强,难以说明试样K对细胞代谢有影响力.试样M（金银花）似乎对两个细胞株都会激发钙离子反应.试样L（白花蛇舌草）对HepG2细胞株不会激发钙离子反应,但是对HL-60细胞株会激发一些细胞反应；试样H对HepG2和HL-60细胞株都会激发钙离子反应,但是相对的三种加味柴胡清肝汤、对于两株肝癌细胞亦具有抗癌活性,而茵陈蒿汤、柴胡清肝汤、茵陈五苓散则不具有意义性的增生抑制作用。从肝癌病因病机探讨中药的抗肝癌活性：肝癌的病因尚未完全肯定,可能与多种因素的综合作用有关,如乙肝病毒、丙肝病毒,肝癌患者百分之80-90%检查HBsAg为阳性,以及相关疾病如肝硬化、胆管炎或结石,因此认为肝炎→肝硬化→肝癌为肝癌发病三步曲。一些化学物质如黄曲霉素、氯二乙烯,亚硝胺、二氧化钍等在实验中被认证实能诱发肝癌。有些肝癌患者有烟酒史、寄生虫（日本血吸虫、肝吸虫）病史。此外,现代食物、药物、环境的污染,一些征量元素缺乏可能与肝癌有关。精神压力、情绪的起伏、身体机体免疫功能低下,细胞分裂异常、细胞表面抗原结构改变,而诱发肝癌。亦符合中医认为肝癌是湿、热、瘀、毒蕴结的病因病机,因此本实验显示清热化湿、清热解毒、散结化瘀药物均具有抗肝癌活性（P<0.05）。中药配伍显示复方的协同药效：从单味试样J、K、L、M所组成的试样H复方,比其各别的单方来得稳定。因此由实验显示,复方的组成依中医药的君、臣、佐、使规律,可产生协同的药效。另外在四组柴胡清肝汤系列中,其主方未能显现作用,但予以加味后即能显示出不同的作用,以试样C效果最好（IC50为25mg/ml, P<0.05）有明显差异,这是再次证明中药配伍的协同妙用。治疗肝癌中药剂量的考量：细胞株存活测试所有复方试样,在高浓度才能检测到有效抑制HepG2细胞株的存活,ICso浓度均在20mg/mL以上,显示中医治疗肝癌的方药剂量应予加倍,因此临床上大剂量的处方及高浓缩纯度的剂型才能显现其疗效。一般疾病的组方剂量,无法连达到其治疗效果。中药的疗效观察评估：在MTT 4-6天的不同日期的检测比对,可发现产生不同的结果,显现中药会有起伏不稳定现象,由于中药复方的复杂性比单方在实验上更加难以掌控,这亦与临床上以4-7天的时间来衡量评估病情的变化及疗效,据以调整处方。中药的疗效需积以时日才能显出其效果,而非即时短暂的效用。中医对于肝癌证治思维的探讨：虽然目前中医治疗肝癌划分多种证型,但从历史沿革、文献的研究以及实验显示,可归结湿、热、瘀、毒为肝癌疾病形成的因数,本实验显示,清肝解毒,祛湿清热,化淤散结的中药试样,均具抑制肝癌细胞成长的活性,初步可支持中医对肝癌证治的论点。总结实验发现以”清肝抗癌方”（Sample H）对人类肝癌细胞株HepG2和HL-60细胞株具有的细胞增生抑制效果,在MTT检测中显示出一致性的趋势。由清肝抗癌方的组成（黄水茄、白花蛇舌草、金银花、斑蝥）来评估中医药的清肝解毒,散结化瘀中药的配伍,此亦符合近代中医临床以解毒散结法,对肝癌的治则治法。抗癌清肝方的单味成分药除试样K外,各别对肝癌细胞增生皆无明显影响。复方的药效,可能与单味成分协同效果有关。因此初步可评估以”清肝抗癌方”（试样H）对人类肝癌细胞株HepG2和HL-60细胞株具有抑制细胞增生的效果,以清热解毒、化瘀散结的治则治法,对治肝癌湿、热、瘀、毒的病机病因,值得进一步研究探讨,以供临床治疗肝癌遣方用药的参考。本研究并非探求单一中药的抗癌成分及其现代医学的机转,而是以中医临床模式在不同的的组成方中,筛选中医药对肝癌细胞的作用,并评估较合理的组方用药,由于中药复方的药物结构非常复杂对实验的方法与内容尚有欠周洋,对单细胞芯片系统的检测,尚有缺陷需要修改,以便于将来进一步研究试样的协同效果。随着生化科技的进步,应用现代科技融合到传统中医药的筛检,以评估临床合理用药和提高疗效提供科学依据。并为中医临床治疗肝癌组方的参考依据,亦是寻求中医药深化科学验证的方法之一种尝试。将来中药的筛选研究可结合生化科技建立中药配伍研究平台。中医名家耆宿邓铁涛说：“中药学溯其源流,从单味药到汤剂（复方）是一大飞跃从复方总结出治则、治法等一整套理论又是一大飞跃。现在中医药理论与现代科学新技术相结合,必然会来第三次飞跃。”拭目以待中医药与现代高科技的结合是带来中医药光辉的未来。本实验研究课题创新点：（1）本研究课题的筛选试样H为中医药临床新组方,尚无任何文献提出研究报告。（2）采用MTT还原法外加入较新的单细胞微流体系统芯片作双重检测结果观察其作用。（3）建立符合中医临床作用的实验模式：即本实验之中药试样,采用一般诊所使用的浓缩科学中药粉,以60℃蒸馏水萃取试样成分,符合病人以热水冲泡温服之临床模式,並观察多日给药的实验结果来筛选评估。（4）目前中药的实验以单味中药居多复方较少,而本实验包涵复方、单方的检测实验。（5）本实验的试样组方大多是现代肝病证治常用且具临床价值的处方。