论文摘要
目的:持续的病毒复制和免疫应答是乙肝治疗的难题,而HMGB1分子是近年在感染性疾病的研究中逐渐被重视的细胞因子,已有的研究发现HMGB1与多种病毒性疾病的发病机制有关。本研究拟通过检测临床各型乙肝患者外周血HMGB1、sRAGE、IL-6含量,肝组织HMGB1、RAGE的表达与分布,并与乙肝临床指标进行分析,以探讨HMGB1对乙肝病毒复制和病理性肝损伤的可能作用,为乙肝的发病机制提供理论依据。方法:1.临床收集各型乙型病毒性肝炎的外周血,运用ELISA和实时荧光定量PCR检测HMGB1、sRAGE、IL-6及HMGB1 mRNA的表达,并与临床指标进行相关性分析。2.采集乙型病毒性肝炎患者肝组织,实时荧光定量PCR检测HMGB1 mRNA的表达量,Western blot、免疫荧光组织化学观察HMGB1、RAGE在肝组织细胞浆、细胞核的表达水平及分布情况,并与临床指标进行相关性分析。结果:1.乙肝患者外周血实时荧光定量PCR结果显示,AsC、CHB-1、CHB-2、CHB-3、SH组的2-△△CT>2,HMGB1 mRNA表达水平呈逐渐上升的趋势,这四组与control组比较,有显著性差异;LC-1、LC-2组的2-△△CT>2,HMGB1 mRNA表达水平呈逐渐上升的趋势,这两组与control组比较,有显著性差异。2.乙肝患者外周血清HMGB1 ELISA结果显示,AsC、CHB-1、CHB-2、CHB-3、SH组,血清HMGB1的浓度逐渐升高;AsC组与control组比较,无显著性差异（P>0.05）;CHB-1组与control组比较,有显著性差异（P<0.05）;CHB-2、CHB-3、SH组与control组比较,有显著性差异（p<0.01）;LC-1、LC-2组与control组比较,血清HMGB1的浓度逐渐升高,有显著性差异（p<0.01）。3.乙肝患者外周血清sRAGE ELISA结果显示,AsC、CHB-1、CHB-2组,血清sRAGE的浓度逐渐减少,与control组比较,具有显著性差异（p<0.01）;CHB-3、SH组,血清sRAGE的浓度逐渐增多,与control组比较具有显著性差异（p<0.01）;LC-1、LC-2组,血清sRAGE的浓度逐渐升高,与control组比较具有显著性差异（p<0.01）。4.乙肝患者外周血清IL-6 ELISA结果显示,AsC、CHB-1、CHB-2、CHB-3、SH组与control组比较,血清IL-6的浓度逐渐升高;在AsC组与control组比较,表达无显著性差异（P >0.05）;CHB-1组与control组比较,表达有显著性差异（P<0.05）;LC-1、LC-2组与control组比较,血清IL-6的浓度逐渐升高,表达有显著性差异（P<0.01）。5.各指标Spearman秩相关分析显示:control、AsC、CHB-1、CHB-2、CHB-3、SH、LC-1、LC-2组中外周血HMGB1与TBIL、IL-6、HBV - DNA均成正相关（r分别为0.495、0.886、0.511,P<0.01）;与PTA、A、CHE均成负相关（r分别为-0.849、-0.848、-0.727, P< 0.01）。control、AsC、CHB-1、CHB-2组中外周血HMGB1与sRAGE成负相关（r为-0.873,P<0.01）;CHB-3、SH、LC-1、LC-2中外周血HMGB1与sRAGE成正相关（r为0.832,P<0.01）。6.乙肝患者肝组织实时定量PCR结果显示,AsC、CHB-1、CHB-2、LC-1组的2-△△CT>2,表示这四组较control组HMGB1 mRNA表达水平有显著性差异,其中AsC、CHB-1、CHB-2组较control组,HMGB1 mRNA表达水平呈逐渐上升的趋势。7.乙肝患者肝组织总蛋白Western blot结果显示,在AsC、CHB-1、CHB-2、LC-1组较control组中HMGB1蛋白表达具有显著性差异（P<0.01）,其中,AsC、CHB-1、CHB-2比control组HMGB1蛋白表达水平逐渐升高。AsC、CHB-1、CHB-2、LC-1组较control组RAGE蛋白表达水平逐渐升高,差异具有显著性（P<0.01）。8.乙肝患者肝组织细胞胞浆蛋白Western blot结果显示,在AsC、CHB-1、CHB-2、LC-1组较control组中HMGB1蛋白表达具有显著性差异（P<0.01）,其中,AsC、CHB-1、CHB-2比control组HMGB1蛋白表达水平逐渐升高。AsC、CHB-1、CHB-2、LC-1组较control组RAGE蛋白表达水平逐渐升高,具有显著性差异（P<0.01）。9.乙肝患者肝组织细胞胞核蛋白Western blot结果显示,在AsC组较control组HMGB1蛋白表达水平增多,具有显著性差异（P<0.05）; CHB-1、CHB-2组均较control组HMGB1蛋白表达水平增多,具有显著性差异（P<0.01）;LC-1组较control组HMGB1蛋白表达水平增多,但无显著性差异（P>0.05）。10.乙肝患者肝组织总蛋白HMGB1与临床各指标Spearman秩相关分析显示:control、AsC、CHB-1、CHB-2、LC-1组中HMGB1与TBIL成正相关（r为0.725,P<0.01）;与PTA、A、CHE均成负相关（r分别为-0.736、-0.684、-0.861, P<0.01）;与HBV– DNA无相关（r为0.008,P>0.05）。11.乙肝患者肝组织免疫荧光组织化学观察结果表示,各组肝组织肝细胞浆、肝细胞核都有HMGB1分布,以在肝细胞浆表达为主,control、AsC、CHB-1、CHB-2组的肝细胞浆、肝细胞核HMGB1表达逐渐增多,以肝细胞浆HMGB1增多较为明显; LC-1组肝组织肝细胞细胞浆、细胞核的HMGB1表达较control组增多,以肝细胞浆HMGB1增多较为明显。12.乙肝患者肝组织免疫荧光组织化学观察结果表示,在各组肝组织肝细胞核内几乎无RAGE分布,RAGE主要表达在肝细胞浆与细胞膜上。RAGE在Control、AsC、CHB-1、CHB-2、LC-1组的表达逐渐增多。结论:1.乙肝患者外周血的HMGB1 mRNA和HMGB1蛋白的表达明显高于正常对照组,且与疾病的严重程度有关,病情越严重,HMGB1的表达越多,说明HMGB1可能影响乙肝的病理性变化。2. HMGB1的浓度和组织的炎症及纤维化程度对sRAGE的表达有影响,说明HMGB1可能协同sRAGE影响乙肝炎症反应、乙肝后肝硬化的病理过程。3. HMGB1与临床指标TBIL成正相关;与CHE、A、PTA均成负相关;说明HMGB1影响肝脏的新陈代谢功能,即表明HMGB1可能会成为判断肝功能的一个新指标。4.乙肝患者肝组织的HMGB1 mRNA表达水平随着疾病的严重程度变化,进一步说明了HMGB1与乙肝疾病的病情变化相关。5.乙肝患者外周血HMGB1与HBV-DNA呈正相关,但是肝组织总蛋白的HMGB1与HBV-DNA无相关性,由于HMGB1在肝细胞的胞核和胞浆中功能状态未知,仍不能排出HMGB1与HBV复制的相关性,需进一步的研究以论证。6. HMGB1在肝组织的细胞核、细胞浆的表达随着疾病的类型不同有差异,说明HMGB1在组织细胞的分布情况影响着它的功能状态,肝组织的炎症能改变HMGB1的生成分泌。7. RAGE在肝组织中,随乙肝疾病严重程度变化而增多,特别是在肝硬化组有明显的表达,血液中的HMGB1也随着乙肝疾病程度而增加,表明外周血的HMGB1可能通过受体RAGE对乙肝后肝硬化病理过程有重要的影响。