马传染性贫血病毒弱毒疫苗致弱过程病毒基因的进化研究

论文摘要

20世纪70年代,哈尔滨兽医研究所研制成功的马传染性贫血病毒（Equine Infectious Anemia Virus, EIAV）弱毒疫苗为控制马传染性贫血（Equine InfectiousAnemia,EIA）在我国的流行做出了重要的贡献。该研究成果荣获1982年国家发明一等奖。该疫苗克服了慢病毒疫苗的开发难点,能在被免疫动物体内产生坚强的保护性免疫,是迄今为止唯一广泛应用并证明确实有效的慢病毒疫苗。马传染性贫血弱毒疫苗的成功,其中必定蕴藏着慢病毒致弱或诱导保护性免疫的机制,在HIV疫苗开发屡受挫折的背景下,系统阐明EIAV疫苗的减毒和保护机理,为HIV等慢病毒疫苗的研究提供参考。EIAV弱毒疫苗是由自然野毒株经马体、驴体和体外培养的驴外周血白细胞及驴胎皮肤细胞长期传代培养而成。本文通过PCR和RT-PCR的方法分别扩增EIAV弱毒疫苗制备过程中不同代次病毒株的前病毒基因组序列、EIAV驴白细胞弱毒疫苗（EIAVDLV121）及其亲本毒株EIAVLN40感染马匹后5个月内病毒S2/gp90序列,并进行序列分析比较。研究结果表明：（1）EIAV在体外传代致弱过程中LTR、env和S2等区域是主要的变异区域：随着病毒在体外传代培养次数的增加,各病毒株与亲本毒株的遗传距离逐渐增加；伴随着病毒毒力的逐渐减弱,在基因组的各个区域出现了一系列稳定变异位点,包括Gag的100A/T、103T/S和484D/N的替换;Pol的16K/E、598K/R和619N/D的替换；gp90的46A/E、98G/R、103H/Y、189K/E、190E/K、193S/N、236D/-、237N/K、247E/K和321K/E的替换；Tat的7R/H的替换；S2的41T/I、51T/I和55Q/K的替换；Rev的74V/I的替换；LTR负调节区的细胞因子AP-1结合位点、增强子区E box基序、R区的转录起始位点和TAR的起始位点的变异。（2）EIAVLN40在体内进化过程中病毒分为两个大的分支,感染早期和无症状阶段的病毒处在同一分支,发病阶段的病毒和EIAVLN40处在进化树的另一分支;gp90的变异主要分布在8个变异区,V3、V4和V5区的糖基化位点的变化通常与发病状态有关,EIAVLN40和多数发病后的序列在这三个区域都具有糖基化位点191NSSN194、237NNTW240和280NDTS283；病毒进化过程中,S2有12%以上的氨基酸出现稳定的替换,这些变异的出现与疾病发展相关。（3）EIAVDLV121在体内进化过程中病毒gp90分成三个大的分支,各时间点分离的病毒gp90与EIAVLN40的平均差异在0.91%-6.49%之间,与EIAVDLV121的差异在3.88%-6.73%之间;病毒S2基因进化过程中分为两个分支,各时间点分离的病毒S2与EIAVLN40的平均差异在0.79%-8.83%之间,与EIAVDLV121的差异在.3.08%-8.14%之间。研究证实：在EIAV弱毒疫苗制备过程中,随着病毒毒力减弱在基因组的各个区域都出现了一系列稳定的变异：EIAVLN40在体内进化过程中gp90和S2的变异与疾病进程的发展相关；EIAVDLV121在体内低水平复制过程中,病毒基因会继续进化,特别是主要的抗原基因gp90的多样性得到进一步丰富,其中包括与强毒株相似的抗原成分。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 马传染性贫血病毒概述
• 1.1.1 EIAV形态结构和理化特性
• 1.1.2 EIAV的细胞嗜性
• 1.1.3 EIAV的致病性
• 1.2 EIAV的分子生物学特特性
• 1.2.1 EIAV的复制过程
• 1.2.2 EIAV基因组结构
• 1.2.3 EIAV的基因及其编码蛋白
• 1.3 国内外不同EIAV毒株及其分子特征
• 1.4 我国EIAV弱毒疫苗致弱路线及研究进展
• 1.5 本研究的目的与意义
• 2 EIAV弱毒疫苗制备过程中前病毒基因组变异分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 EIAV前病毒基因组的扩增
• 2.2.2 EIAV弱毒疫苗致弱过程中前病毒基因组遗传进化分析
• 2.2.3 EIAV弱毒疫苗致弱过程中前病毒基因组变异分析
• 2.3 讨论
• 2.4 结论
• 3 EIAV弱毒疫苗亲本强毒株EIAVLN40的进化特点
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 EIAVLN40感染马匹临床症状
• 3.2.2 目的片段的扩增与序列比较分析
• 3.2.3 EIAVLN40的GP90基因进化特点
• 3.2.4 EIAVLN40的S2基因进化特点
• 3.3 讨论
• 3.3.1 EIAVLN40 GP90的变异与疾病发展的关系
• 3.3.2 EIAVLN40 S2的变异与致病性的关系
• 3.4 结论
• 4 EIAV驴白细胞弱毒疫苗在体内进化特点
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果
• 4.2.1 EIAVDLV121免疫马匹临床症状
• 4.2.2 目的片段的扩增与序列比较分析
• 4.2.3 EIAVDLV121的GP90基因在体内的进化特点
• 4.2.4 EIAVDLV121的S2基因在体内的进化特点
• 4.3 讨论
• 4.4 结论
• 5 论文结论与创新点
• 5.1 论文结论
• 5.2 创新点
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介