载药纳米微粒对恶性黑色素瘤治疗作用体内、体外实验研究

论文摘要

目的:恶性黑色素瘤是常见皮肤恶性肿瘤,早期可以手术治疗,晚期、转移性肿瘤手术效果差,化疗药物效果欠佳,且有较大毒副作用。寻找新的有效治疗药物成为热点。多西紫杉醇（Docetaxel,DOC）和姜黄素（Curcumine）是两种近期被确证对恶性黑色素瘤有治疗效果的药物,但两者存在水溶性差、过敏反应多、作用时间短、使用途径少、一定毒副作用等缺点。这些缺点严重限制了两种药物的效果和使用范围。纳米载药系统拥有靶向特性、缓释特性、高度稳定性、低毒性。聚乙二醇（PEG）-聚己内脂（PCL）壳核结构纳米微球具有双向溶解性,本研究利用PEG-PCL分别包裹多西紫杉醇和姜黄素,在体外、体内对这两种载药纳米微粒的作用、副作用进行了研究,探讨纳米微粒性状、溶解性、药物包裹的效率、靶向性、缓释性、黑色素瘤肿瘤细胞杀伤性,及动物实验效果和毒副作用。方法:（1）采用开环聚合法（ring-opening method）合成聚乙二醇和聚己内酯（mPEG-PCL）嵌合体;采用溶剂分散法制备载DOC的PEG-PCL壳核纳米微粒（DOCNP）,观察是否达到预想效果。并观察其水溶液颜色、透明度。以原子力显微镜、透射电镜观察粒子形态,动态光散射仪测定粒径分布（D）及Zeta电位（U ）。高效液相色谱法测定并计算出DOCNP在不同投药比例时的包封率与载药量。（2）运用透析法测定DOCNP与DOC裸药累积体外释放曲线并进行比较,探讨以PEG-PCL纳米微粒作为载体系统对DOC作用时间的影响;用荧光显微镜观察纳米微粒在肿瘤细胞中的分布;用MTT细胞毒实验比较DOCNP与DOC裸药杀伤肿瘤细胞能力。（3）用B16细胞注射ICR小鼠,制作异体移植的黑色素瘤小鼠模型。静脉给以DOCNP、DOC,测量瘤体大小的变化,同时通过检测小鼠体重变化、观察一般情况比较载药纳米微粒与裸药对小鼠的毒副作用。（4）瘤体内分别注射DOCNP和DOC裸药,测量瘤体大小的变化,同时通过检测小鼠体重变化、观察一般情况比较载药纳米微粒与裸药对小鼠的毒副作用。（5）制备载姜黄素的PEG-PCL壳核纳米微粒（姜黄素NP）,观察是否达到预想效果,并观察其溶液颜色、透明度。以原子力显微镜、透射电镜观察粒子形态,动态光散射仪测定粒径分布（D）及Zeta电位（U ）;测定姜黄素纳米微粒包封率与载药量。（6）运用透析法测定姜黄素NP与姜黄素裸药释放曲线并进行比较,探讨以PEG-PCL纳米微粒作为载体系统对姜黄素作用时间的影响;用MTT细胞毒实验比较姜黄素载药纳米粒与姜黄素裸药杀伤肿瘤细胞能力。（7）用B16细胞注射ICR小鼠,制作异体移植的黑色素瘤小鼠模型,瘤体内分别注射姜黄素纳米粒和姜黄素裸药,观察瘤体大小的变化,同时通过检测小鼠体重、观察一般情况比较载药纳米微粒和裸药对小鼠的毒副作用。结果:（1）DOCPEG-PCL纳米微粒在生理盐水中溶解性明显高于DOC裸药,原子力显微镜、透射电镜显示微粒直径均小于100nm。载药纳米微粒形态呈表面光滑的圆形。动态光散射仪测定微粒电位-5mV ,远低于没有PEG外壳的普通纳米微粒表面的-35mv,证明PEG外壳降低了细胞对纳米粒的排斥力。DOCNP的包封率达90%,最高载药量达19.4%。（2）在B16细胞中,DOCNP的释放曲线明显低于DOC裸药的释放曲线,提示DOCNP有良好的缓释效果;免疫荧光显示与香豆素-6共同包裹的DOCNP进入了肿瘤细胞的细胞核周围的细胞浆,提示有良好的靶向性;细胞毒试验显示DOCNP杀死肿瘤细胞的效率较DOC裸药略强。（3）黑色素瘤移植瘤小鼠,静脉注射DOCNP和DOC裸药后,相同剂量组比较:DOCNP组小鼠肿瘤生长较裸药组缓慢,两组肿瘤生长速度差异有统计学意义;DOCNP组小鼠体重减轻明显低于DOC组。（4）黑色素瘤移植瘤小鼠,瘤体内注射DOCNP和DOC裸药后,相同剂量比较:DOCNP组小鼠瘤内注射肿瘤生长较静脉注射缓慢,体重减轻低于静脉注射小鼠。瘤内注射DOCNP组小鼠肿瘤生长明显较瘤内注射DOC组缓慢,两组肿瘤生长速度差异有统计学意义;DOCNP组小鼠体重减轻明显低于DOC组。（5）姜黄素纳米微粒生理盐水中溶解度明显高于姜黄素裸药,透射电镜、原子力显微镜显示微粒直径<100 nm,形态呈表面光滑的圆形。动态光散射仪测定平均微粒电位外壳的普通-7.6mV,低于无PEG外壳的纳米微粒。姜黄素NP的包封率89%,最高载药量达16.3%。（6）在B16细胞中,姜黄素NP释放曲线明显低于姜黄素裸药的释放曲线,提示姜黄素NP有良好的缓释效果;细胞毒试验提示姜黄素NP杀死肿瘤细胞的效率较姜黄素裸药有增强。（7）黑色素瘤移植瘤瘤体内注射姜黄素NP和姜黄素裸药后,姜黄素NP组小鼠肿瘤生长明显较姜黄素组缓慢,姜黄素NP组小鼠体重减轻低于姜黄素裸药组,一般情况优于姜黄素组小鼠。结论:（1）多西紫杉醇载药纳米微粒具有良好的水溶性,有缓释特性;与多西紫杉醇裸药比较体外有略高的杀黑色素瘤细胞效果;载药纳米粒静脉注射较裸药静脉注射有明显增强的抑制肿瘤生长的作用;载药纳米粒瘤内注射较静脉注射有明显增强的抑制肿瘤生长的作用,副作用明显降低;载药纳米粒瘤内注射较裸药瘤内注射有明显增高的抑制肿瘤生长的作用,副作用明显降低。（2）姜黄素载药纳米微粒具有良好的水溶性;与姜黄素裸药比较体外杀肿瘤细胞效果有增强;瘤内注射抑制肿瘤生长效果较裸药明显增强,副作用明显降低。（3）两种载药纳米微粒在本研究中都表现出良好的治疗效果和明显减轻的毒副作用,纳米载药研究将为黑色素瘤的治疗提供有力帮助。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 参考文献
• 第一部分 多西紫杉醇纳米微粒对恶性黑色素瘤治疗作用体内外实验研究
• 摘要
• 1 引言
• 2 材料和方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 小结
• 参考文献
• 第二部分 姜黄素载药纳米微粒对恶性黑色素瘤治疗作用体内外实验研究
• 摘要
• 1 引言
• 2 材料和方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 小结
• 参考文献
• 综述
• 综述Ⅰ纳米技术在肿瘤诊断治疗中研究进展
• 参考文献
• 综述Ⅱ恶性黑色素瘤非手术治疗进展
• 参考文献
• 已发表的论文
• 发表文章情况
• 致谢