蛋白质组分析条件的优化与弱精症患者精液比较蛋白质组学研究

论文摘要

目的优化基于MALDI-TOF-MS的蛋白质组分析条件,研究弱精症患者与正常生殖能力者精液中精子和精浆蛋白质表达差异,探讨弱精不育机制。方法在优化蛋白质组分析条件时,选取对蛋白组研究结果有较大影响的MALDI-TOF-MS分析条件、数据准确度、搜索引擎采用、数据库选择以及主要参数设置进行考察,用BSA数据来建立标准参数模型,以CAH2BOVIN、Hsp70s数据为训练对象检验标准参数,最后获得优化的蛋白质分析条件。在弱精症患者精液比较蛋白质组学研究中,收集临床上确认的弱精症精液样本,分别制备精子和精浆;采用2-DE分离/银染检测差异表达蛋白策略进行图谱分析,对差异表达蛋白以胰蛋白酶（trypsin）酶解,肽段混合物经MALDI-TOF-MS鉴定获得PMF数据,MS-Fit数据库搜索,最终获得有关蛋白质的信息。结果1、以BSA质谱数据为研究对象,考察了经MALDI-TOF-MS获得PMF时分析条件及准确度对蛋白质数据库搜索结果的影响。2、以CAH2BOVIN质谱数据为训练集建立模型,然后以人Hsp70s数据进行检验,优化了PMF鉴定蛋白质的生物信息学分析条件。3、以弱精患者精子/精浆为研究对象,在不同的条件下进行2-DE,获得了较高分辨率的凝胶图谱,同时分离得到的蛋白质点满足了质谱分析的要求。4、弱精患者组与正常组精子的比较蛋白质组学研究:与正常组比较,从弱精患者组精子样本中发现高度表达而正常样本中缺失或表达下调的27个蛋白点以及在正常精子中存在而在弱精不育精子中缺失或低表达的37个点,经PMF鉴定和蛋白质数据库搜索,初步找到了47相关蛋白质。5、弱精患者组与正常组精浆的比较蛋白质组学研究:从正常组样本中发现24个蛋白点高表达（3个在不育缺失）,18个蛋白点在不育高表达（3个蛋白点在正常缺失）,经肽质量指纹谱鉴定和蛋白质数据库搜索获得36个蛋白相关信息,并对EHD1、PSMA、KLC1和CDC25A等蛋白进行了Western blot确认。结论MALDI-TOF-MS的离子化是一种由基质介导的、复杂的固相/气相过程,分析条件的选择对后续蛋白质搜索结果的影响十分明显,合适的分析条件可以给实验结果带来高可信度。要获得正确的PMF必须高度重视质谱分析条件的选择与优化。质谱分析参数的选择包括质谱精确度的控制、激光强度的选择、加速电压的设定、延迟时间和激光击打次数的选择等。与经典的蛋白质研究不同,在蛋白质组学的研究工作中,是通过质谱数据与蛋白质数据库的比对来获得鉴定结果的,如果所获得的质谱数据有误差,或与蛋白质数据库比对时的参数设置不合理,将对搜索结果产生很大的影响。本研究的结果表明,Swissprot最适合于做PMF搜索的数据库;从搜索引擎来说,通过两个引擎进行搜索是较为合理的,这样可避免漏检和降低候选蛋白的误选几率;对漏切位点、质量容错数等参数的选择应根据研究要求进行优化。弱精患者的精子蛋白质组对应于蛋白质的转录、合成、转换、转运等环节,均出现了相关功能蛋白的上调或下调。精浆蛋白质组的差异表达蛋白大部分是跟精子发生、成熟过程有关的活性蛋白。在两种蛋白质组中,还发现了一批功能未知的蛋白。这些结果为后续研究打下了重要基础,从蛋白质组学的角度,为弱精不育研究创造了条件。

论文目录

• 符号说明
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 参考文献
• 第一部分 蛋白质组分析条件的优化
• 第一章 MALDI-TOF-MS 分析条件及准确度对蛋白质数据库搜索结果影响
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 第二章 肽质量指纹谱鉴定蛋白质时数据库搜索条件的优化
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 第二部分 弱精症患者精液比较蛋白质组学研究
• 第一章 精液蛋白质样本处理和双向电泳技术建立
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 第二章 弱精组与正常组精子的比较蛋白质组学研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 第三章 弱精症与正常组精浆比较蛋白质组学研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 全文总结
• 文献综述
• 致谢
• 攻读硕士学位期间参加的课题及发表的论文目录