长链胰岛素样生长因子1（LR~3IGF1）在毕赤酵母中的表达、纯化及活性分析

论文摘要

人的胰岛素样生长因子1（huIGF-1）是类似于胰岛素原的单链多肽激素。其调节多种细胞的生长及分化。与胰岛素不同的是huIGF-1可由人体多种组织产生,循环过程中也保持了相对高的浓度。它的缺乏会导致多种严重的疾病。因而它也成为具有多种治疗用途的药物。修饰天然huIGF-1 N端氨基酸后得到的类似物,生物学活性得到了明显提高。推测是由于类似物与胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBP）的结合能力下降导致的。其中的一种类似物—长链-Arg3IGF1（LRIGF-1）,是将天然huIGF-1 Glu3替换成Arg,同时在其N端引入了13个延伸氨基酸组成的融合蛋白,这13个氨基酸的组成是Val-Asn后加上甲硫氨酰-猪生长激素前11个氨基酸。这种IGF-1类似物具有与天然IGF-1几乎相同的二级结构,所以推测其同样具有与天然IGF-1相同的生物学活性。因而,开发其作为天然IGF1的替代药物的前景最为看好。毕赤酵母遗传操作简单,而且相对于哺乳动物细胞来说毕赤酵母易于低成本、高密度培养。更重要的是毕赤酵母是真核细胞,能可溶表达外源蛋白,同时能对表达的外源蛋白进行正确的翻译后修饰,从而保证了外源蛋白正确的折叠及功能的完整。此外,通过同源重组,外源蛋白的cDNA能高效、稳定地整合进宿主染色体中,不仅如此,通过对表达载体操作,我们可以很容易得到多拷贝靶蛋白、不同亚基的多聚体及人工替换靶蛋白亚基的表达。毕赤酵母表达系统还有另一大优点是具有的强启动子能驱动外源基因的高效表达,因而能以简单的技术及低成本得到大量的靶蛋白。这是其他哺乳动物细胞无可比拟的。本研究目的是利用毕赤酵母表达天然人胰岛素样生长因子1的类似物:长链-Arg3IGF-1（LR3IGF-1）。鉴于毕赤酵母表达系统具有的多种优点,因而我们希望利用这种表达系统产生得到LR3IGF-1,进而探讨了其生物活性。本研究中我们首先利用毕赤酵母对密码子的偏好性人工合成LR3IGF-1基因。将其定向克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA上得到LR3IGF-1表达载体pαA-LR3IGF1。电击转化毕赤酵母宿主菌KM71。筛选高表达菌株后,诱导表达并纯化,初步鉴定表达得到的LR3IGF-1纯度及分子内二硫键配对情况,并初步分析了毕赤酵母表达系统得到的LR3IGF-1体外刺激细胞增殖的生物活性。由于长链-Arg3IGF1分子内存在3对二硫键。其正确的配对对LR3IGF-1的空间结构有重要影响,进而影响其生物活性。因而外源表达LR3IGF-1过程中,确保3对二硫键的正确的配对至关重要。本研究发现,LR3IGF-1能在毕赤酵母中得到较高效表达,表达量达到40mg/L。表达产物能通过离子交换层析和分子筛凝胶层析得到有效纯化。更重要的是,纯化后靶蛋白能正确形成天然的空间结构。且生物学活性较好。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 胰岛素样生长因子1的研究进展
• 1.1.1 IGF-1的发现
• 1.1.2 IGF-1的生化性质
• 1.1.3 IGF-1的基因及成熟肽结构
• 1.1.4 IGF-1合成分泌及活性的调节
• 1.1.5 IGF-1的生理作用
• 1.1.6 IGF-1的治疗应用
• 1.1.7 IGF-1的副作用
• 1.1.8 展望
• 1.2 巴斯德毕赤酵母表达系统
• 1.2.1 巴斯德毕赤酵母表达系统的优点
• 1.2.2 巴斯德毕赤酵母的生物学特性
• 1.2.3 毕赤酵母表达宿主菌株
• 1.2.4 毕赤酵母表达载体的选择
• 1.2.5 巴斯德毕赤酵母的转化与基因整合
• 1.2.6 阳性克隆的筛选
• 1.2.7 密码子偏好与蛋白表达的关系
• 1.2.8 胞内表达与胞外分泌表达的选择
• 1.2.9 培养条件的优化
• 1.3 研究目的及主要研究内容
• 2 实验部分
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 质粒载体及菌种
• 2.1.2 工具酶
• 2.1.3 试剂（盒）及耗材
• 2.1.4 主要仪器
• 2.1.5 培养基和实验用液
• 2.2 实验方法与步骤
• 2.2.1 人工合成长链-Arg3IGF1基因
• 2.2.2 表达质粒pαA-LR3IGF1的构建
• 2.2.3 表达质粒pαA-LR3IGF1转化毕赤酵母菌KM71
• 2.2.4 高表达转化子的筛选
• 2.2.5 小量诱导表达及表达产物鉴定
• 2.2.6 不同诱导发酵条件对表达量的影响
• 2.2.7 重组蛋白纯化
• 2.2.8 重组蛋白浓度及纯度分析
• 2.2.9 重组蛋白生物活性鉴定
• 3 实验结果
• 3IGF1基因'>3.1 人工合成长链-Arg³IGF1基因
• 3.2 表达质粒pαA-LR3IGF1的构建
• 3.3 电击转化毕赤酵母宿主菌
• 3.4 PCR鉴定阳性转化子
• 3.5 高表达转化子的筛选
• 3.6 小量诱导表达及表达产物鉴定
• 3.7 不同诱导条件对蛋白表达量的影响
• 3.7.1 不同诱导时间对表达量的影响
• 3.7.2 不同诱导剂（甲醇）剂量对表达量的影响
• 3.7.3 不同培养液pH值对表达量的影响
• 3.8 重组蛋白纯度分析
• 3.8.1 HPLC分析重组蛋白纯度
• 3.8.2 BCA测定诱导上清中总蛋白含量
• 3.9 重组蛋白生物活性鉴定
• 4 讨论
• 5 研究结果小结及后续研究
• 5.1 研究结果小结
• 5.2 后续研究
• 参考文献
• 致谢
• 附录1.重组人胰岛素样生长因-1的一级结构
• 附录2. Ppic9K与PpicZαA的比较