猪Sox9基因cDNA的全长克隆及功能预测

论文摘要

Sox基因是由众多富含HMG盒DNA绑定蛋白区域的基因家族,Sox9属于Sox家族成员之一,Sox9是与早期胚胎发育有关的基因,是与位于雄性动物Y染色体上的Sry相关的睾丸决定因子,可与DNA序列特异结合,在很多动物中都有表达,因此在进化上非常保守。在人类SOX9突变可引起CD综合征和性反转。在睾丸和卵巢中都可以检验到Sox9mRNA6勺转录本,暗示它在性腺发育的作用,显示它在猪的性腺中可能具有同样功能。对猪Sox9基因的克隆测序和初步分析,可以为研究猪Sox9基因的生物学功能和品种改良提供基础的基因信息,也为研究人的基因功能建立动物试验模型提供参考。本研究采用电子克隆的方法,结合RT-PCR和RACE技术,获得了猪Sox9基因的cDNA全序列。利用生物信息学方法预测了该蛋白的结构和功能,并进行了同源序列多重比对和分子系统发生分析。利用实时定量PCR（Real-time quantitative PCR）技术分析了猪Sox9基因mRNA在不同组织的相对表达水平,具体内容如下:1 Sox9基因的克隆测序用人的Sox9基因的cDNA全序列作为电子探针,分别从NCBI的dbEST和UniGene数据库钓取了共12条猪的EST序列,将其输入DNAstar-SeqMan程序,最后拼接出1个重叠群（Contig1）序列。在此基础上,利用Primet Premier 5.0软件手动设计引物,借助RT-PCR和RACE技术一方面验证了电子克隆的正确性;另一方面扩增出ORF和cDNA全序列。2 Sox9蛋白的生物信息学分析借助借助生物信息学网络资源和软件,猪Sox9基因定位于12p13-p11,预测出完整的ORF编码框,位于第357-1886bp核苷酸之间,开放阅读框的长度为1530bp,编码509个氨基酸残基;通过对Sox9启动子的预测,可能性高于0.8的有10个启动子,从第187bp开始到第1541bp为CpG岛,长度为1355bp。CpG位点有151个;通过对蛋白质序列相似性检索,预测出猪Sox9蛋白不合有信号肽,不含有跨膜区,定位于细胞核中,在509个氨基酸中从第104到174位共71个氨基酸残基构成HMG盒,功能区主要是HMG盒。发现有HMG、DnaJ、GIT、HSF和Prim-Zn-Ribbon结构域。推测猪Sox9蛋白是一种核蛋白,有DNA结合能力,参与染色质修饰和基因转录调控。3 Real-time quantitative PCR分析Sox9基因的组织表达谱采用实时荧光定量PCR技术,按照双标准曲线法,分析了猪Sox9不同组织中的相对表达水平,结果表明:Sox9基因在猪的不同组织中广泛表达,但表达水平存在差异。在性腺和脑组织表达水平最高,而在脾、胸腺、淋巴组织表达水平最低,说明了Sox9基因在猪性腺、脑的发育以及软骨发生的功能与作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部 分文献综述
• 第一章 哺乳动物的性别决定相关基因的作用机理
• 摘要
• 1 性腺发育机理
• 2 与睾丸命运决定有关的染色体基因
• 2.1 Sry基因
• 2.2 Sox9基因
• 2.3 Dmrt1基因
• 2.4 威尔姆氏肿瘤抑制基因（Wt1）
• 2.5 抗牟勒氏管激素基因（Amh）
• 2.6 类固醇生成因子1（Sf1）
• 3 与卵巢命运决定有关的染色体基因
• 3.1 Dax1基因
• 3.2 Sox3基因
• 3.3 Wnt4基因
• 4 展望
• 第二章 Sox9基因功能分析及其研究进展
• 摘要
• 1 Sox9基因的结构及蛋白功能特点
• 1.1 Sox9蛋白识别序列的特异性
• 1.2 Sox9是典型的转录因子
• 1.3 Sox9蛋白有许多的磷酸化位点
• 2 Sox9基因在性别分化中的表达作用
• 3 Sox9基因与软骨形成
• 4 与Sox9有关的CD症及性反转
• 5 Sox9在其他发育中的作用
• 第三章 生物信息学模拟在新基因研究的应用
• 1 表达序列标签（EST）
• 2 电子克隆
• 2.1 电子克隆的基本策略
• 2.2 EST序列的获取与拼接延伸
• 3 序列比对和数据库搜索
• 4 核酸的序列分析
• 4.1 编码区（Coding sequence,CDS）分析
• 4.2 基因的电子定位
• 4.3 基因结构分析
• 5 蛋白质结构和功能的预测
• 5.1 预测蛋白质的物理性质
• 5.2 蛋白质二级结构预测
• 5.3 其它特殊局部结构
• 5.4 蛋白质的三维结构
• 6 小结
• 7 本实验的目的和意义
• 第二部分 实验研究
• 第四章 猪Sox9基因cDNA全长的克隆测序
• 1 材料与试剂
• 1.1 实验动物
• 1.2 网络资源及软件
• 1.3 主要试剂及试剂盒
• 1.4 主要仪器
• 1.5 主要溶液及其配制
• 2 实验方法
• 2.1 猪Sox9基因的电子克隆
• 2.2 组织RNA的提取与检测
• 2.35 'RACE引物设计
• 2.4 5'RACE
• 2.5 中间序列扩增和3'RACE引物设计
• 2.6 用接头引物反转录得到基因组cDNA
• 2.7 ORF以及中间序列的扩增
• 2.8 3'RACE
• 2.9 cDNA克隆测序
• 3 结果与分析
• 3.1 猪EST序列的获取
• 3.2 EST序列的拼接与分析
• 3.3 总RNA提取的检测
• 3.4 5'RACE扩增5'UTR
• 3.5 ORF以及中间片段的扩增结果
• 3.6 3'RACE扩增结果
• 3.7 测序结果分析
• 4 讨论
• 4.1 电子克隆技术的优缺点
• 4.2 TOPO TA克隆技术
• 第五章 蛋白质序列的生物信息学分析
• 1 材料与方法
• 1.1 电子基因定位与启动子的预测
• 1.2 ORF区预测
• 1.3 蛋白质氨基酸组成、分子量和等电点分析
• 1.4 蛋白质疏水性分析
• 1.5 蛋白质信号肽预测
• 1.6 跨膜区预测
• 1.7 亚细胞定位预测
• 1.8 蛋白质功能结构域预测
• 1.9 蛋白质氨基酸序列间的多重比对和分子系统发生分析
• 2 结果与分析
• 2.1 电子基因定位与启动子的预测
• 2.2 ORF分析
• 2.3 氨基酸组成、分子量和等电点
• 2.4 疏水性分析
• 2.5 信号肽分析
• 2.6 跨膜区分析
• 2.7 亚细胞定位预测
• 2.8 蛋白质结构域预测
• 2.9 蛋白质序列间多重比对和分子系统发生分析
• 3 讨论
• 第六章 猪Sox9基因的组织表达谱分析
• 1 材料与试剂
• 1.1 实验样品
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 主要溶液及其配制
• 2 实验方法
• 2.1 各组织RNA的提取
• 2.2 RNA浓度和纯度检测
• 2.3 反转录得到基因组cDNA
• 2.4 引物设计
• 2.5 普通PCR扩增
• 2.6 Real-time PCR定量检测
• 3 结果与分析
• 3.1 Sox9基因检测反转录效果
• 3.2 猪Sox9和GAPDH基因的荧光定量
• 3.3 猪Sox9基因mRNA相对表达量检测
• 4 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读硕士期间发表的学术论文