四氢嘧啶类化合物LH-2703抗炎免疫药理作用的研究

论文摘要

目的：以丁炔二酸二乙酯、甲醛、苯胺为原料,合成四氢嘧啶类化合物LH-2703,探讨其抗炎镇痛及免疫药理作用。方法：1、以丁炔二酸二乙酯、甲醛、苯胺为原料,合成四氢嘧啶类化合物LH-2703（1,3-二苯基-1,2,3,6-四氢嘧啶-4,5-二甲酸二乙酯）,经柱层析分离纯化；2、取昆明种小鼠50只,随机均分为5组,分别为溶媒对照组,阿司匹林阳性药物组（200mg/kg.b.w）及化合物LH-2703高、中、低剂量组（200、100、50mg/kg.b.w）。各组均用0.5%CMC-Na的水溶液配制。采用二甲苯诱导小鼠耳廓肿胀模型每日灌胃1次,连续给药3天。末次给药后1h,在每只小鼠右耳上均匀涂布二甲苯40μl（耳廓内外两侧各20μl）致炎,30min后将小鼠颈椎脱臼处死,沿耳廓线剪下左、右耳片,用内径为8mm的打孔器分别在左、右耳相同位置打下耳片,称重,计算耳廓肿胀度；3、取SD大鼠40只,随机均分为5组,分别为溶媒对照组,阿司匹林阳性药物组（200mg/kg.b.w）及化合物LH-2703高、中、低剂量组（200、100、50mg/kg.b.w）。各组均用0.5%CMC-Na的水溶液配制。每日灌胃1次,连续给约3天。末次给药后60mmin,从大鼠右后足趾向远心端方向皮下注射高压灭菌的1%角叉菜胶生理盐水液0.1ml／只大鼠,并用记号笔在踝关节处做好标记,用大鼠足趾容积测量仪分别在注射1%角叉菜胶生理盐水液,1、2、3、4及5h时刻测定大鼠右后足容积。计算大鼠足趾肿胀度；4、取昆明种小鼠60只,随机均分为5组,分别为溶媒对照组,阿司匹林阳性药物组（200mg/kg.b.w）及化合物LH-2703高、中、低剂量组（200、100、50mg/kg.b.w）。各组均用0.5%CMC-Na的水溶液配制。灌胃给药,单次给药后60mmin,按0.1ml/10g.b.w腹腔注射新配制的0.7%醋酸生理盐水液。观察并记录注射0.7%醋酸生理盐水液后20min内小鼠扭体次数；5、取健康昆明种小鼠50只,实验前将鼠尾进入（50±0.5）℃恒温水浴锅,记录甩尾反应潜伏期为痛阈。预选痛阈5-30s者为合格鼠。随机均分为5组,分别为溶媒对照组,盐酸曲马多阳性药物组（10mg/kg.b.w）及化合物LH-2703高、中、低剂量组（200、100、50mg/kg.b.w）。各组均用0.5%CMC-Na的水溶液配制。单次灌胃给药,于给药后0.5h时测定小鼠痛阈值；6、取昆明种小鼠50只,体重（20±2）g,雌性,实验前经55℃热板筛选剔除痛阈值大于30s或小于5s的动物,随均分为5组,分别为溶媒对照组,曲马多阳性药物组（10mg/kg.b.w）及化合物LH-2703高、中、低剂量组（200、100、50mg/kg.b.w）。各组均用0.5%CMC-Na的水溶液配制。灌胃给药1次。于给药后0.5h测定痛阈,以小鼠足部接触热板到开始舔后足的时间为痛阈值。观察并记录痛阈；7、采用Griess试剂盒观察其对正常小鼠巨噬细胞分泌一氧化氮（NO）的影响；ELISIA法检测白细胞介素-1（IL-1β）含量；8、MTT法检测正常小鼠脾细胞的代谢活力；9、采用小鼠碳粒廓清、溶血素及迟发型变态反应模型分别观察其对正常小鼠非特异性免疫、体液免疫及细胞免疫的影响。结果：合成了四氢嘧啶类化合物LH-2703（1,3-二苯基-1,2,3,6-四氢嘧啶-4,5-二甲酸二乙酯）,经硅胶柱层析分离纯化,其结构经MS、1H-NMR和13C-NMR确证。化合物LH-2703在高、中、低剂量（200、100、50mg/kg.b.w）均能显著抑制二甲苯诱导的小鼠耳廓肿胀,平均耳廓肿胀抑制率分别为53.1%、46.3%、26.6%,与溶媒对照组比较有统计学意义（P<0.001,P<0.001,P=0.013）；测量时间为3h时,化合物LH-2703在高、中剂量时（200、100mg/kg.b.w）对大鼠足趾肿胀均有显著抑制,平均抑制率分别为46.4%、33.9%,与溶媒对照组比较有统计学意义（P<0.001,P=0.007）；化合物LH-2703高、中、低剂量（200、100.50mg/kg.b.w）均能显著减少正常小鼠扭体反应次数,平均扭体反应抑制率分别为51.3%、40.8%、25.1%,与溶媒对照组比较有统计学意义（P<0.001,P=0.002,P=0.047）；化合物LH-2703高剂量组（200mg/kg.b.w）对小鼠热水浴甩尾反应潜伏期能显著延长,痛阈提高百分率为36.4%,与溶媒对照组比较有统计学意义（P=0.044）；LH-2703高、中剂量组（200、100mg/kg.b.w）对小鼠热板法的痛阈时间显著延长,痛阈提高百分率分别为48.0%、23.7%,与溶媒对照组比较有统计学意义（P<0.001,P=0.006）；化合物LH-2703高浓度组（20μg/ml）对腹腔巨噬细胞产生NO和IL-1p都有不同程度的抑制作用,抑制率分别为26.8%、29.9%,与LPS对照组比较有统计学意义（P=0.036,P=0.009）；化合物LH-2703对正常小鼠的非特异性免疫、体液免疫及细胞免疫,均没有显著作用。结论：1、以丁炔二酸二乙酯、甲醛、苯胺为原料,经氨基化作用、Mannich反应、亲核加成反应和脱氨基环化等多组分反应合成了四氢嘧啶类化合物LH-2703,方法具有操作简单,原料易得,反应条件温和,反应收率高等优点。2、反应粗产物经硅胶柱层析,以石油醚：乙酸乙酯（V：V=1：7-1：5）为流动相分离纯化,方法操作简单、易行。3、化合物LH-2703对二甲苯诱导的小鼠耳廓肿胀和角叉菜胶诱导的大鼠足趾肿胀度均有良好的抑制作用,提示其具有良好的抗炎作用。4、化合物LH-2703可以显著减少醋酸所致小鼠扭体次数和延长扭体潜伏期,并有一定的剂量依赖关系,提示其具有良好的外周镇痛活性。5、化合物LH-2703在200mg/kg.b.w剂量时可以显著延长热水浴甩尾及热板法的痛阈值,提示其具有良好的中枢镇痛活性。6、化合物LH-2703可以显著抑制巨噬细胞NO和IL-1β的分泌,且有一定的剂量依赖性,提示其具有良好的抑制炎症因子的作用。7、化合物LH-2703对正常小鼠的非特异性免疫、体液免疫及细胞免疫,均没有显著作用,提示其对体内免疫系统无显著影响。8、化合物LH-2703对小鼠正常脾细胞代谢活力有一定的抑制作用,提示其对体外免疫细胞有一定调节作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 研究背景
• 1 非甾体抗炎药物概述
• 2 立题依据
• 参考文献
• 第二章 四氢嘧啶类化合物LH-2703的合成
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 参考文献
• 第三章 LH-2703的抗炎镇痛活性研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 参考文献
• 第四章 LH-2703的免疫活性研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 参考文献
• 附录
• 附图
• 攻读学位期间成果
• 致谢
• 统计学证明