阻断ICOS共刺激通路抗肝移植急性排斥的研究

论文摘要

第一部分 大鼠 ICOS 小干扰 RNA 表达质粒的构建与鉴定 目的:成功构建针对大鼠活化 T 淋巴细胞可诱导共刺激分子（ICOS）基因编码区的小干扰 RNA（siRNA）表达质粒 pICOS,观察其对大鼠活化 T 淋巴细胞表面 ICOS 表达的影响。 方法:根据 RNA 干扰（RNAi）作用原理设计针对大鼠活化 T 淋巴细胞 ICOS 的 siRNA,利用 pGenesil-2 质粒,构建重组干扰质粒pICOS-A 及其阴性对照质粒 pICOS-B,并经酶切及测序鉴定,用脂质体 Lipofectamine 转染大鼠 T 淋巴细胞,RT-PCR 检测其对 T 细胞 ICOS 基因表达的抑制作用。 结果:经酶切反应及测序证实重组干扰质粒 pICOS-A 及阴性对照质粒 pICOS-B 构建成功;其中干扰质粒 pICOS-A 对活化 T 淋巴细胞ICOS 基因的表达有较好的抑制效果,RNA 水平抑制率为 84.5%,而其阴性对照质粒则无抑制作用。 结论:大鼠 ICOS 的 siRNA 具有明显和特异性的抑制活化 T 淋巴细胞 ICOS 基因表达的作用。 第二部分 阻断 ICOS 共刺激通路抑制大鼠肝移植急性排斥反应目的:研究利用 RNAi 阻断 T 淋巴细胞 ICOS 共刺激通路在大鼠原位肝移植急性排斥反应中的作用。方法:用“二袖套法”行 Lewis 鼠到 Brown Norway（BN）鼠大鼠原位肝移植 18 例,随机分成干扰组、排斥组和对照组,每组各 6 例,其中干扰组于术中回输已转染重组干扰质粒 pICOS-A 的 BN 鼠淋巴细胞（2×106,1 ml）,对照组回输已转染空载体 pGenesil-2 的 BN 鼠淋巴细胞（2×106,1 ml）,而排斥组则输入生理盐水 1 ml。观察各组 BN 鼠 1周存活率,于术后第 8 天每组杀死 BN 鼠 3 只,取外周静脉血流式细胞仪分别检测 CD25 和 ICOS 在 T 细胞中的阳性率,取肝组织观察病理变化,末端脱氧核苷酸转移酶介导的 dUTP 缺口末端标记法（TUNEL 法）检测肝组织细胞凋亡情况,RT-PCR 检测 T 细胞 ICOS基因的表达,免疫组织化学和 Western blot 检测 T 细胞 ICOS 蛋白的表达,取脾脏分离淋巴细胞,混合淋巴细胞反应观察刺激指数,ELISA检测血清TNF-α、IFN-γ 含量。结果:干扰组 1 周存活率为 83.3%,明显高于排斥组和对照组,均为 50%（P<0.01）;排斥组和对照组病理示中、重度急性排斥反应,干扰组急排反应不明显;流式分析示干扰组外周血 T 细胞中 ICOS 阳性率为 21.3±1.4%,明显低于排斥组的 39.1±4.6%和对照组的 39.1±2.1%（P<0.01）,干扰组外周血 T 细胞中活化 T 细胞（CD25 阳性）比例为15.2±0.7%,也明显低于排斥组的 21.6±0.6%和对照组的 20.8±0.9%（P< 0.01 ）; TUNEL 法 示 干 扰 组 肝 组 织 中 有 较 多 凋 亡 T 细 胞（51.3±11.0/mm2）,明显高于排斥组的 26.3±4.2/mm2（P<0.01）;RT-PCR、Western blot 和免疫组织化学均提示干扰组肝组织 ICOS 基因和蛋白表达受抑制;混合淋巴细胞反应示干扰组 BN 鼠对 Lewis 鼠产生

论文目录

• 符号说明
• 中文摘要
• 英文摘要
• 论文正文 阻断ICOS 共刺激通路抗肝移植急性排斥的研究*
• 前言
• 参考文献
• 第一部分 大鼠ICOS 小干扰RNA 表达质粒的构建与鉴定
• 材料与方法（Experimental materials and methods）
• 实验结果（Experimental results）
• 讨论（Discussion）
• 参考文献
• 第二部分 阻断ICOS 共刺激通路抑制大鼠肝移植急性排斥反应
• 材料与方法（Experimental materials and methods）
• 实验结果（Experimental results）
• 讨论（Discussion）
• 参考文献
• 附图
• 文献综述一 可诱导共刺激分子在移植免疫中的研究进展
• 文献综述二 肝脏中死亡受体介导的细胞凋亡
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的论文
• 攻读硕士学位期间科研获奖情况
• 攻读硕士学位期间参与的科研课题
• 攻读硕士学位期间参与的学术会议