论文摘要
慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染呈世界性流行,全球约20亿人曾感染过或正在感染HBV,其中3.5亿人为慢性HBV感染者,每年约有100万人死于HBV感染相关的肝衰竭、肝硬化和原发性肝癌。拉米夫定（lamivudine,LVD）作为是第一个获得批准上市用于抗HBV治疗的口服类药物,其问世标志着慢性乙型肝炎进入核苷类似物治疗时代。阿德福韦酯（adefovir dipivoxil,ADV）是阿德福韦的前体核苷酸类似物,除了可以有效地抑制HBV野生毒株复制,体内和体外研究都证实阿德福韦也可有效地抑制拉米夫定耐药毒株复制,成为第一个在全球批准上市用于拉米夫定治疗失效慢性乙型肝炎的口服核苷酸类似物。恩替卡韦（entecavir,ETV）,环戊酰鸟苷类似物,是继拉米夫定后的第二个获得批准上市用于治疗慢性乙型肝炎的核苷类似物,对于初治患者和拉米夫定治疗失效患者均具有显著的抗HBV作用。近年来陆续有来自不同人群接受阿德福韦酯治疗慢性乙型肝炎的临床资料,其中来自亚洲的资料提示接受阿德福韦酯治疗的患者耐药发生率高于全球多中心临床试验结果。临床研究分析了与阿德福韦酯耐药发生的相关因素,但不同的研究得出的结论各不相同,部分甚至相互矛盾。为了进一步了解和掌握在临床实践中接受阿德福韦酯单一治疗的慢性乙型肝炎患者病毒学应答和阿德福韦耐药情况,并探讨病毒学应答、HBeAg血清学应答和阿德福韦耐药发生的相关预测因素。我们对在本院就诊的患者进行了临床随访研究,102例患者炎?004年至2007年在南方医院感染内科住院或门诊就诊的慢性乙型肝炎病人,所有患者均接受阿德福韦酯单一治疗超过12个月,基线HBV DNA水平=4log10copies/mL,包括HBeAg阳性或HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者,包括核苷（酸）类似物初治患者和拉米夫定治疗失效患者。所有患者定期检测肝肾功能、HBV DNA定量、雅培乙肝标志物检测和病毒耐药性检测。耐药性检测采用直接测序法,从患者血清中提取HBV DNA,进行半巢式PCR,对PCR产物进行直接测序,测序结果与GenBank报道的HBV序列进行同源性比对检测耐药变异位点。入选患者平均年龄35±10岁,13.7%为女性患者,20.6%为肝硬化患者,71.6%为HBeAg阳性患者。58名（56.9%）患者为经直接测序确认为拉米夫定基因型耐药患者（rtM204I/V）,44（42.7%）名患者接受阿德福韦为初始治疗,HBV基因B型（49/48.0%）,HBV基因C型（53/52.0%）。平均ALT水平为126±112IU/L（25-597 IU/L）,平均血清HBV DNA水平为6.1±1.3log10copies/mL(4-9log10copies/mL)。拉米夫定耐药组患者的基线血清HBV DNA水平（P=0.004）和ALT水平（P=0.017）显著低于初治患者。随访中观察到45名（44.1%）患者获得了早期病毒学应答（EVR）,60名患者（58.8%）获得了初始病毒学应答（IVR）。获得IVR的患者和未获得IVR的患者在年龄、性别、HBV基因型、基线ALT水平、基线HBV DNA水平和肝硬化患者比例方面都没有显著性差异。HBeAg阴性患者取得初始病毒学应答的比率显著高于HBeAg阳性患者（88.1 vs.60.0%,P=0.018）。治疗第3个月时取得EVR的患者在治疗6个月时获得初始病毒学应答的比率显著高于未获得EVR的患者（P=0.000）,获得IVR的患者在治疗12个月时获得完全病毒学应答的比率显著高于未获得IVR的患者（P=0.000）。39名患者（38.2%）获得了完全病毒学应答,治疗第3个月时24名（23.5%）获得了完全病毒学应答,治疗第6个月时35名（34.3%）获得了完全病毒学应答。获得EVR和/或IVR的患者获得完全病毒学应答（CVR）的比率显著高于未获得EVR和/或IVR的患者（P=0.000）。患者的基线资料包括年龄、HBeAg状态、血清ALT和HBV DNA水平、HBV基因型、肝硬化与患者是否获得完全病毒学应答无显著相关。患者在治疗第6个月获得初始病毒学应答是治疗第12个月时是否获得完全病毒学应答的独立预测因素。患者获得IVR是获得CVR的正向独立预测因素,而男性和拉米夫定耐药是患者获得CVR的负向独立预测因素。65（63.7%）和81（79.4%）名患者分别在治疗6个月和12个月时血清ALT水平恢复或保持在正常值内。获得IVR的患者在治疗6个月和12个月时血清ALT复常率显著高于未获得IVR的患者。随访过程中,对入选患者的肾功能进行监测,实验室生化学检查未提示与阿德福韦相关的肾功能损害。在接受阿德福韦酯治疗前,73例为HBeAg阳性患者,随访过程中,17例（23.3%）出现HBeAg阴转,治疗第12、18、24个月的累计HBeAg阴转率分别为10%,27%和41%。17例出现HBeAg阴转的患者中,14例获得HBeAg血清学转换,治疗第12、18、24个月的累计HBeAg血清学转换率分别为7%,18%和28%。Cox多因素分析提示,完全病毒学应答（CVR）是HBeAg阴转的独立预测因素。16例（15.7%）患者经直接测序法检测到阿德福韦耐药变异,该16例均为二次应答失败或应答欠佳的患者,其中14例既往曾接受过拉米夫定抗病毒治疗,并发生了基因型耐药,2例为初治患者。拉米夫定耐药患者和初治患者在治疗12个月和24个月时的累计耐药率分别为9%,38%和3%,9%（P=0.008）。年龄、基线HBeAg状态、肝硬化和拉米夫定耐药与阿德福韦耐药变异的发生相关,肝硬化是患者发生阿德福韦耐药变异的唯一的独立预测因素（HR=4.49,95%CI:1.30-15.55,P=0.018）。16例阿德福韦基因型耐药变异阳性的患者中,8例耐药变异位点为rtN236T,3例rtA181V,1例rtA181T+rtN236T,1例rtA181T+rtV214A。本研究在3例患者中检测到2个与阿德福韦酯治疗相关的变异位点rtV214I和rtN236I,经克隆测序鉴定发现3例患者中均检测到rtN236T耐药变异,同时检测到rtV214I和rtN236V单独或联合出现在同一株HBV DNA链上。本研究对102例接受阿德福韦酯单一治疗的患者的临床随访观察到44.1%的患者获得早期病毒学应答,58.8%的患者获得初始病毒学应答,38.2%的患者获得完全病毒学应答。拉米夫定耐药患者接受阿德福韦酯单一治疗的耐药率显著高于初治患者;患者获得早期病毒学应答和/或初始病毒学应答可以预测患者远期持续血清学应答;阿德福韦耐药显著相关的危险因素包括年龄大、HBeAg阴性状态、肝硬化和拉米夫定耐药,其中肝硬化是独立预测因素,提示阿德福韦耐药阳性的疾病谱与肝硬化相关。我们的研究并没有发现多个耐药变异突变位于同一条HBV DNA链上,研究结果支持对于多种核苷（酸）类似物耐药患者给予联合治疗（拉米夫定联合阿德福韦酯）有效。本研究收集了115例在我院接受拉米夫定治疗的CHB患者的临床资料,采用PCR产物直接测序法检测HBVP基因RT区序列耐药变异:其中103例检测到拉米夫定基因型耐药变异,最主要的耐药变异模式为rtL180M+rtM204V和rtM204I,分别占58.3%和22.3%,其他耐药位点包括rtL80V/I,rtT184S,rtA200V,并在5例患者中检测到RT区3个位点的联合变异,我们认为对拉米夫定治疗患者的耐药性检测除了HBV P基因区常见的rtL180和rtM204位点变异外,还应考虑可以其他位点的联合耐药变异。作为拉米夫定治疗失效的救援疗法之一,新一代的核苷类似物,恩替卡韦具有强大的抗病毒活性和较高的基因耐药屏障,本研究对41例在本院接受口服恩替卡韦1.0mg/d治疗的拉米夫定治疗失效患者进行临床随访,入选患者恩替卡韦治疗疗程超过12个月且其基线HBV DNA=104copies/mL。随访中,39%的患者取得HBV DNA转阴（＜103copies/mL）,64%基线ALT水平异常的患者ALT水平恢复正常值（＜40IU/L）,2名（7.7%）的HBeAg阳性患者在治疗第10个月和第12个月时分别取得HBeAg血清学转换。1例患者发生了恩替卡韦基因型耐药变异,耐药位点为rtL180M+rtM204V+rtS202G,该名患者的基线血清中可检测到拉米夫定耐药突变rtL180M+rtM204V。本研究认为恩替卡韦1.0mg/d治疗拉米夫定失效慢性乙型肝炎临床证实有效,但应警惕耐药变异的发生。前面两部分是对接受核苷（酸）类似物治疗慢性乙型肝炎患者临床随访的横向研究,第3部分我们选取了分别于2001年、2002年和2004年在我院肝病中心开始接受拉米夫定抗病毒治疗的3例患者,入选患者在治疗前为核苷（酸）类似物初治患者,接受拉米夫定后的序贯治疗包括阿德福韦酯单一治疗、阿德福韦酯和拉米夫定联合治疗和恩替卡韦单一治疗,治疗过程中3例患者均发生了恩替卡韦基因型耐药变异。收集和记录患者在接受拉米夫定阶段定期检测HBVDNA的血清和临床资料,定期检测其HBV DNA定量、乙型肝炎病毒标志物、肝功能和耐药性检测,患者在治疗前、出现病毒学突破、出现病毒学反弹、治疗无应答、换药和停药等各时间点进行克隆测序,各时间点挑取10-25个克隆。本研究提示序贯治疗患者体内可以同时存在拉米夫定、阿德福韦和恩替卡韦耐药株,其核苷与核苷酸类似物耐药变异分别位于不同的HBV DNA链上,同一核苷（酸）类似物的多个耐药位点单独或组合位于同一条HBV DNA链上,形成多种耐药突变的混合存在,提示对于已经发生耐药的患者,即使是对于序贯治疗中先后使用的2种核苷和核苷酸类似物的联合治疗仍然有效。本研究中的2例患者在接受恩替卡韦治疗前已可以检测到rtL180M+rtM204V+rtS202G,检测到恩替卡韦耐药株阳性的时间点1号患者为接受拉米夫定治疗的第34个月时,2号患者为接受拉米夫定治疗26个月并停用24个月后（期间服用阿德福韦）,2例患者既往均发生了拉米夫定基因型和临床型耐药,提示拉米夫定治疗可以筛选出恩替卡韦耐药株,而导致恩替卡韦原发性耐药。随着治疗时间的延长,不但发生拉米夫定耐药的风险增加,而且,筛选出恩替卡韦耐药株的可能性也增加,这给拉米夫定治疗失效患者的后续救援治疗带来困难。