基于Ver-1基因LAMP法检测饲料产黄曲霉毒素真菌的研究

论文摘要

黄曲霉毒素（Aflatoxin,简写AF）是一种真菌毒素,主要由黄曲霉菌和寄生曲霉菌产生,它影响机体的免疫系统、致突变、致畸、致癌,对动物体和人体健康造成严重威胁。我国最新的饲料卫生标准对霉菌和毒素都做了严格要求。目前检测黄曲霉毒素的方法有薄层层析法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）、酶联免疫吸附法（ELISA）等。而目前检测霉菌的方法局限于传统的真菌培养法以及PCR方法,前者操作十分麻烦,时间需要4～7天,后者对仪器以及反应条件比较高,难以推广。为此,本试验建立环媒恒温基因扩增（LAMP）法检测产黄曲霉毒素真菌,并且应用于饲料样品检测。本试验研究内容主要包括:基于Ver-1基因建立LAMP法快速检测黄曲霉毒素真菌,并应用于饲料的检测;应用ELISA法检测样品中AFB1毒素含量,并比较分析ELISA和LAMP检测结果。本试验研究结果主要如下:1.基于Vet-1基因设计LAMP引物,参照LAMP原理以及相关技术要求,建黄曲霉毒素真菌的LAMP检测法。通过优化扩增条件,使得该方法快速,灵敏,准确。将该方法成功的应用于饲料产毒素真菌的检测。最后,为了将该方法能广泛推广,完善改进了样品处理、DNA释放、灵敏度的调整、检测结果判断等相关试验,单个样品检测时间为2小时,每个样品的检测成本约在3.5元。2.从五家饲料公司,多家养殖场采取饲料样品共180个,经过样品处理后进行LAMP检测,结果阳性为35个,阴性145个。参照国标,采用ELISA对以上饲料样品进行黄曲霉毒素B1的测定。结果显示阳性为38个,阴性为142个。综合样品的AFB1检测结果和样品的LAMP检测结果,两种检测结果吻合率达91.67%。实验结果表明,LAMP法检测饲料中黄曲霉毒素真菌特异性强、敏感性高,检测快速,成本低,而且可以同时检测多个样品。LAMP法和ELISA法检测结果吻合率高,支持饲料中AFB1含量与黄曲霉毒素真菌正向相关。总之,LAMP法检测饲料中黄曲霉毒素真菌适合基层饲料卫生检测,值得广泛推广。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 黄曲霉毒素及其研究进展
• 1.1 黄曲霉毒素及其理化性质
• 1.2 黄曲霉毒素的产生
• 1.3 黄曲霉毒素的毒性
• 1.4 黄曲霉毒素的危害
• 1.5 黄曲霉毒素污染饲料情况
• 1.6 饲料中黄曲霉毒素最高限量的规定
• 1.7 黄曲霉毒素检测方法研究进展
• 2 环媒恒温基因扩增技术及其研究概况
• 2.1 LAMP检测结果判断方法
• 2.2 LAMP研究进展
• 2.3 结语
• 第二章 LAMP法检测产黄曲霉毒素真菌的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 模板制备
• 2.2 LAMP法反应条件的优化
• 2.3 LAMP法反应体系的确立
• 2.4 特异性试验
• 2.5 敏感性试验
• 3 讨论
• 3.1 黄曲霉LAMP法目的基因的选择与引物设计
• 3.2 模板制备
• 3.3 黄曲霉LAMP快速检测方法的建立
• 3.4 黄曲霉LAMP检测法的条件优化
• 3.5 黄曲霉LAMP法的特异性和灵敏性
• 3.6 LAMP法检测黄曲霉真菌的优点
• 4 小结
• 第三章 LAMP法检测饲料产黄曲霉毒素真菌的应用
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 LAMP法检测饲料中产黄曲霉毒素真菌方法的确立
• 2.2 LAMP法检测饲料样品结果的两种判断方法
• 2.3 LAMP法和ELISA法检测样品结果的比较分析
• 3 讨论
• 1以及毒素霉菌的污染情况'>3.1 饲料中AFB₁以及毒素霉菌的污染情况
• 3.2 饲料中毒素与霉菌的相关性分析
• 1的注意事项'>3.3 用ELISA方法检测饲料AFB₁的注意事项
• 3.4 LAMP法检测饲料中黄曲霉毒素真菌的综合评价
• 3.5 LAMP法检测饲料中黄曲霉毒素真菌技术上的创新与突破
• 3.6 LAMP法试剂盒检测饲料中黄曲霉毒素真菌的可行性分析
• 4 小结
• 第四章 总结及下一步工作设想
• 1 结论
• 2 下一步工作设想
• 参考文献
• 附录A.论文中的重要英文缩写
• 附录B.主要试剂配制
• 致谢
• 作者简介