重组腺病毒介导肝细胞生长因子促进脂肪移植成活的研究

论文摘要

自体颗粒脂肪移植因其来源丰富,为自身组织、无排斥反应等优点,是理想的修复软组织缺损的材料。但脂肪细胞对缺血敏感,移植早期血运不能及时建立,造成部分脂肪细胞坏死,降低了脂肪移植的成活率,及时的再血管化成为提高脂肪成活率的重要因素。肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor,HGF）是目前已知作用最强的促血管生长因子,具有诱导血管生成和抑制瘢痕增生的作用,能刺激多种细胞的增殖,并具有抗细胞凋亡的作用。为观察HGF在移植脂肪成活中的作用以及对移植脂肪血管化的影响,我们进行了利用重组腺病毒介导肝细胞生长因子促进脂肪移植成活的实验研究。目的:①观察腺病毒介导的肝细胞生长因子（Ad-HGF）对脂肪干细胞的感染效率以及感染后是否可形成有效的HGF,确定感染强度（multiplicity ofinfection,MOI）值。②观察Ad-HGF在裸鼠颗粒脂肪移植中脂肪成活的影响及血管化的影响。方法:利用消化分离方法和脂肪干细胞贴壁生长的特性,分离人脂肪干细胞,脂肪干细胞均呈贴壁生长的成纤维细胞样形态,原代培养的细胞7-10天即达70%-80%融合。应用携带GFP基因的腺病毒载体（Ad-GFP）感染脂肪干细胞,以GFP为报告基因,确定重组腺病毒对脂肪干细胞的感染效率。通过流式检测,腺病毒感染强度MOI=300pfu/细胞时,感染效率最高可达95.64%,利用相同MOI的Ad-HGF感染脂肪干细胞,ELISA法检测HGF的表达,结果表明Ad-HGF感染脂肪干细胞后HGF可在48h高效表达。提示腺病毒可有效介导HGF在脂肪干细胞中表达。在上述实验的基础上,进行了Ad-HGF在裸鼠颗粒脂肪移植中的实验研究,将30只6周龄的CD-1裸鼠随机分三组,每组10只,每只裸鼠于头皮下注射所抽取的人腹部脂肪颗粒1ml,实验组:在脂肪颗粒中加入Ad-HGF;对照组1:加入Ad-GFP;对照组2:在颗粒脂肪中加入生理盐水,注射脂肪后裸鼠饲养10周。于注射脂肪后的第1天、4天、8天、15天,分别采裸鼠尾血,HGF-ELISA试剂盒检测血清HGF浓度,发现实验组明显高于对照组,说明HGF基因感染脂肪干细胞后生成了可溶性HGF。饲养裸鼠10周,全部成活,称重后处死,解剖脂肪移植物,对移植物进行称重比较,并对移植物进行病理切片HE染色、Ⅷ因子免疫组化染色。实验组的脂肪移植物称重明显高于对照组,两个对照组间无显著差异,证实HGF可明显提高移植脂肪的成活率,减少移植脂肪的吸收。病理结果分析显示:实验组脂肪形成空泡的数目明显少于对照组,表明HGF可促进脂肪组织的生长。免疫组化显示:实验组血管密度明显高于对照组,表明HGF在脂肪移植过程中具有明显的促血管生长作用。三组裸鼠在其饲养十周后组间体重无显著差异,说明HGF未影响到裸鼠的一般生长。通过以上结果,我们可以得出:①Ad-HGF可有效感染脂肪干细胞,感染后可持续生成可溶性的HGF。②Ad-HGF可应用于脂肪组织的移植中,它可通过促进移植脂肪组织的再血管化,促进移植脂肪成活,提高脂肪移植成活质量。本研究为肝细胞生长因子在脂肪移植中的应用提供了实验依据,为组织工程脂肪的血管化研究提供一种有效的方法,为转基因脂肪组织工程的临床应用开辟了新思路。

论文目录

• 缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 课题设计与图解
• 前言
• 文献综述
• 提高自体颗粒脂肪移植成活的研究进展
• 实验一:Ad-HGF感染ADSC效率检测及HGF表达检测
• 1.材料
• 2.方法
• 3.结果
• 4.讨论
• 实验二:Ad-HGF在颗粒脂肪移植中的效果评价
• 1.材料
• 2.方法
• 3.结果
• 4.讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 致谢