论文摘要
目的:研究腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）介导的结缔组织生长因子（connective tissue growth factor,CTGF）和基质金属蛋白酶组织抑制因子1（tissueinhibitor of metalloproteinases 1,TIMP1）单基因及双基因体外联合转染恒河猴椎间盘细胞的生物学效应,并观察双基因体内转染退变的恒河猴腰椎间盘的生物学效应。方法:体外实验:通过酶消化法培养恒河猴腰椎间盘髓核细胞,以不同感染复数（multiplicity of infection,MOI）的rAAV2-EGFP（enhanced green fluorescent protein,EGFP）转染髓核细胞,确定最佳的感染复数。以最佳感染复数的rAAV2-CTGF、rAAV2-TIMP1及rAAV2-CTGF-IRES-TIMP1病毒质粒分别感染髓核细胞,用Westernblot鉴定细胞因子的表达,通过RT-PCR、35S及番红O染色观察CTGF、TIMP1及双基因联合感染髓核细胞的细胞生物学作用。体内实验:CT引导下经皮穿刺纤维环诱导恒河猴腰椎间盘退变,微创经皮注入双基因病毒质粒,应用RT-PCR、Westernblot鉴定细胞因子的表达,RT-PCR、35S及组织学染色观察双基因联合感染对退变椎间盘的生物学作用。结果:体外部分:通过rAAV2-EGFP转染猴腰椎间盘髓核细胞,发现MOI为106时,转染效率较高。rAAV2-CTGF、rAAV2-TIMP1及rAAV2-CTGF-IRES-TIMP1双基因能够转染恒河猴椎间盘髓核细胞,并在其内表达细胞因子。与对照组相比,CTGF可以促进Ⅱ型胶原及蛋白多糖的合成,TIMP1可以促进蛋白多糖的合成,对Ⅱ型胶原的合成未见到明显作用。双基因联合感染可以促进髓核细胞蛋白多糖和Ⅱ型胶原的合成,其效果优于单基因。体内部分:经皮穿刺纤维环的方法可以建立椎间盘退变的早期模型,rAAV2-CTGF-IRES-TIMP1双基因可以在体内长期表达,并能促进体内蛋白多糖和Ⅱ型胶原的合成。结论:CTGF可以促进Ⅱ型胶原及蛋白多糖的合成,TIMP1可以促进蛋白多糖的合成,对Ⅱ型胶原的合成未见到明显作用。双基因联合感染可以促进蛋白多糖和Ⅱ型胶原的合成,其效果优于单基因。
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摘要Abstract前言1单基因及双基因联合体外转染恒河猴腰椎间盘髓核细胞的生物学效应'>第一部分 CTGF和TIMP1单基因及双基因联合体外转染恒河猴腰椎间盘髓核细胞的生物学效应一、材料（一） 实验动物和病毒颗粒（二） 实验试剂和仪器（三） PCR引物及探针二、恒河猴腰椎间盘髓核细胞的培养及鉴定（一） 恒河猴腰椎间盘髓核细胞的培养（二） Western blot鉴定恒河猴腰椎间盘髓核细胞的Ⅱ型胶原的表达（三） 番红O染色观察髓核细胞蛋白多糖的表达（四） 恒河猴腰椎间盘髓核细胞的超微结构观察2-EGFP测定不同感染复数的腺相关病毒对恒河猴腰椎间盘髓核细胞的感染效率'>三、rAAV2-EGFP测定不同感染复数的腺相关病毒对恒河猴腰椎间盘髓核细胞的感染效率（一） 转染步骤（二） 荧光倒置显微镜观察1单基因及双基因联合体外转染恒河猴腰椎间盘髓核细胞后两细胞因子的表达'>四、CTGF和TIMP1单基因及双基因联合体外转染恒河猴腰椎间盘髓核细胞后两细胞因子的表达（一） 转染步骤1及双基因转染时两细胞因子mRNA的表达'>（二） RT-PCR检测CTGF、TIMP1及双基因转染时两细胞因子mRNA的表达1及双基因转染时两细胞因子的表达'>（三） Western blot鉴定CTGF、TIMP1及双基因转染时两细胞因子的表达1单基因及双基因联合体外转染恒河猴腰椎间盘髓核细胞的生物学效应'>五、CTGF和TIMP1单基因及双基因联合体外转染恒河猴腰椎间盘髓核细胞的生物学效应1单基因及双基因联合体外转染对Ⅱ型胶原mRNA的表达的影响'>（一） RT-PCR检测CTGF和TIMP1单基因及双基因联合体外转染对Ⅱ型胶原mRNA的表达的影响1单基因及双基因联合体外转染对蛋白多糖的表达的影响'>（二） CTGF和TIMP1单基因及双基因联合体外转染对蛋白多糖的表达的影响1 RT-PCR检测转染前后髓核细胞蛋白多糖mRNA的表达35S整合法测定转染前后髓核细胞蛋白多糖合成率'>235S整合法测定转染前后髓核细胞蛋白多糖合成率3 番红O染色观察蛋白多糖的合成1单基因及双基因联合体外转染恒河猴腰椎间盘髓核细胞生物学效应的比较'>六、CTGF和TIMP1单基因及双基因联合体外转染恒河猴腰椎间盘髓核细胞生物学效应的比较（一） 单基因与双基因对Ⅱ型胶原mRNA表达的影响（二） 单基因与双基因对蛋白多糖mRNA表达的影响35S整合法检测单基因与双基因对蛋白多糖合成的影响'>（三）35S整合法检测单基因与双基因对蛋白多糖合成的影响七、小结1双基因联合体内转染恒河猴退变腰椎间盘的生物学效应'>第二部分 CTGF和TIMP1双基因联合体内转染恒河猴退变腰椎间盘的生物学效应一、材料（一） 实验动物（二） 实验试剂和仪器二、恒河猴腰椎间盘退变动物模型的建立（一） 实验动物分组（二） CT引导下经皮穿刺造模（三） 造模前后腰椎间盘MRI观察（四） 实验椎间盘组织学观察1 收获椎间盘组织2 HE染色3 Masson染色4 番红O染色5 免疫组化染色三、双基因联合转染恒河猴退变腰椎间盘的方法及表达鉴定（一） 体内动物实验分组（二） CT引导下微创经皮注射病毒质粒至髓核1的mRNA表达'>（三） RT-PCR检测CTGF和TIMP1的mRNA表达1两细胞因子的表达'>（四） Western-Blot法检测CTGF和TIMP1两细胞因子的表达四、双基因联合转染恒河猴退变腰椎间盘的生物学效应（一） 实验椎间盘的组织学观察1 HE染色2 Masson染色3 番红O染色4 免疫组化染色（二） RT-PCR检测Ⅱ型胶原mRNA的含量（三） RT-PCR检测蛋白多糖mRNA的含量35S整合法检测髓核组织中蛋白多糖合成'>（四）35S整合法检测髓核组织中蛋白多糖合成五、小结讨论一.椎间盘细胞的培养二.CTGF的生物学功能1的生物学功能'>三.TMIP1的生物学功能四.基因导入方式的选择五.基因载体的选择六、椎间盘退变模型的建立七、基因转染在动物体内的持续表达的时间结论参考文献综述攻读学位期间的研究成果附录致谢
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标签：腺相关病毒论文; 腰椎间盘退变论文; 模型论文; 经皮微创纤维环穿刺论文; 恒河猴论文;
腺相关病毒介导的CTGF和TIMP1双基因联合转染恒河猴腰椎间盘退变的实验研究
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