论文摘要
中药现代化是当今中医药发展过程中所面临的重大问题,而中药的药物代谢动力学研究一直是中药现代化的难点之一。大多数中药在体内的代谢尚不清楚,致使其临床应用缺乏科学依据,而影响疗效或引起不良反应。CYP450酶是药物体内代谢最重要的酶,其中6种重要的CYPs亚型:CYP1A2,CYP2C9,CYP2C19,CYP2D6,CYP2E1和CYP3A4参与了约90%的临床使用药物的代谢。CYP450酶被抑制是引起药物相互作用、导致药物不良反应发生的重要原因。有关中药对CYP450酶影响的报道较少,且主要集中在中药有效成分、中药提取物和单味中药对CYP450酶单一亚型的影响。由于临床使用多为中药,而非单一有效成分;且中药单独使用、配伍应用对CYP450酶的作用结果可能有较大差异甚至相反,因此进行中药对CYP450酶影响的相关研究已迫在眉睫。本研究通过体外实验筛选灯盏细辛注射液等37种中药对大鼠CYP3A、CYP2E1和CYP2C9的抑制作用,并进一步通过体内实验研究筛选出的中药对大鼠CYP450酶的影响,以期丰富传统中药理论,指导临床合理用药。材料和方法1.大鼠肝微粒体的制备大鼠断头处死,迅速取出肝脏,用冰冻的Tris缓冲液反复冲洗,采用钙沉淀法制备肝微粒体,微粒体沉淀用蔗糖磷酸盐缓冲液重悬,分装,-70℃保存。2.微粒体蛋白含量的测定取牛血清白蛋白标准品配制成的标准溶液,各取60μL标准溶液,加入3 mL考马斯亮蓝染色液于595nm波长处比色测定,绘制标准曲线。取已制备好的肝微粒体悬液60μL,进行测定并计算微粒体蛋白的含量。3.孵育反应孵育体系总体积500μL,反应体系中包含NADPH,磷酸盐缓冲液,EDTA,MgCl2,微粒体蛋白和探针药物,探针药物分别为咪达唑仑(10μmol·L-1),氯唑沙宗(100μmol·L-1),甲苯磺丁脲(20μmol·L-1),反应在37℃水浴中进行,预孵育5min,加入NADPH启动反应。实验分为对照组和实验组,实验组加入中药,对照组加入等体积的磷酸盐缓冲液。4.酶活性测定高效液相色谱法（HPLC）测定探针药物浓度,以探针药物的生物转化程度作为酶活性指标。5.刺五加注射液对大鼠CYP3A的抑制作用按照随机对照原则,20只雄性SD大鼠分为2组,一组为对照组,每天尾静脉注射生理盐水(40ml·kg-1),连续给药7天;另一组为实验组,每天尾静脉注射刺五加注射液(40ml·kg-1),连续给药7天,大鼠断头处死,制备肝微粒体,测定肝微粒体的蛋白含量,进行孵育反应。6.统计分析应用SPSS10.0软件对各项数据资料进行统计分析,实验数据皆用平均数±标准偏差（（?）±SD）表示,对照组与实验组之间的比较采用独立样本t检验,检验水准a为0.05。结果1.对CYP3A4、CYP2E1和CYP2C9有抑制作用的中药通过体外实验筛选发现灯盏细辛注射液、茵栀黄注射液、清开灵注射液、香丹注射液、刺五加注射液、清热解毒口服液和鼻渊舒口服液7种中药对CYP3A有抑制作用（P＜0.05）:茵栀黄注射液对CYP2E1有抑制作用;37种中药对CYP2C9酶的活性均无抑制作用。2.中药对CYP3A4、CYP2E1和CYP2C9的IC50中药对CYP450酶的抑制作用呈浓度依赖性,随着中药浓度的增加,其对CYP450酶的抑制作用也随之增强,灯盏细辛注射液、茵栀黄注射液、清开灵注射液、香丹注射液、刺五加注射液、清热解毒口服液、鼻渊舒口服液对CYP3A酶的IC50分别为2.09ml·100ml-1、1.34ml·100ml-1、2.17ml·100ml-1、1.97ml·100ml-1、5.00ml·100ml-1、1.21ml·100ml-1和1.14ml·100ml-1;茵栀黄注射液对CYP2E1的IC50为1.17ml·100ml-1。3.中药与其成分的比较茵栀黄注射液、清开灵注射液、鼻渊舒口服液与其主要成分对CYP3A酶的抑制作用相比均无显著性差异,清热解毒口服液对CYP3A的抑制作用显著强于其所含成分（P＜0.05）。茵栀黄注射液与其所含成分对CYP2E1的抑制作用相比无显著性差异。4.刺五加注射液对大鼠CYP3A的抑制作用大鼠连续7天静脉注射40ml·kg-1刺五加注射液,CYP3A酶活性显著低于对照组（P＜0.01）,使探针药物咪达唑仑的代谢减少了约（21.11±9.39）%（P=0.002）。结论1.灯盏细辛注射液、茵栀黄注射液、清开灵注射液、香丹注射液、刺五加注射液、清热解毒口服液和鼻渊舒口服液7种中药体外对CYP3A酶活性具有抑制作用。2.茵栀黄注射液抑制CYP2E1酶的活性。3.37种中药对CYP2C9酶活性均无抑制作用4.中药对CYP450酶的抑制作用呈浓度依赖性,随着中药浓度的增加,对CYP450酶的抑制作用随之增强。5.大鼠注射刺五加注射液,CYP3A酶活性显著被抑制。
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