基于Gap-LCR技术建立EGFR基因突变的检测方法

论文摘要

EGFR基因突变与治疗非小细胞肺癌关系密切,肺癌目前已经成为最常见的恶性肿瘤之一,其中非小细胞肺癌占到肺癌总量的75%-85%,但由于传统的化疗毒副作用较大,近年来随着对其发病机制的深入研究,以表皮生长因子受体（EGFR）为靶标的新一代的分子靶向治疗受到普遍关注,酪氨酸机酶抑制剂如吉非替尼、厄罗替尼已被美国食品药品管理局（FDA）批准用于治疗晚期非小细胞肺癌。临床研究显示,吉非替尼、厄洛替尼治疗非小细胞肺癌疗效与EGFR基因突变关系密切,携带EGFR基因突变的患者对吉非替尼、厄洛替尼更为敏感,其总生存期和无进展生存期均比无突变的患者显著增加。因此,检测EGFR基因突变对于选择吉非替尼及厄洛替尼治疗非小细胞肺癌是非常必要的。本研究建立了一种新的检测EGFR基因突变的方法,根据Gap-LCR技术的反应原理,对于EGFR每个突变位点设计一对探针,然后在DNA聚合酶和DNA连接酶的作用进行聚合连接反应,以产物的有无来判断EGFR基因型。最后通过三种检测手段来检测基因中是否存在突变,这三种方法分别为琼脂糖凝胶电泳、Qubit检测系统和通用寡核苷酸芯片检测。我们选择了EGFR基因的热点突变,包含了7个SNP位点突变和2个长片段的缺失,成功克隆了所有位点的突变型基因,作为此方法的阳性质控。本方法具有良好的检测灵敏度,可达到5%,高于传统的测序方法。于对10例非小细胞肺癌病人的样本进行检测,发现有3例携带EGFR基因突变,突变频率与文献报道一致。本方法灵敏度高,其优点在于不需要昂贵的仪器和特殊的试剂,仅需要普通的PCR仪即可完成实验,尤其是琼脂糖凝胶电泳检测在一般的实验室平台就可以完成,Qubit检测系统方便快捷,而通用寡核苷酸芯片检测则可完成高通量的检测。本方法适用于各级临床检测,对于实现个体化用药有非常重要的意义。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 前言
• 第一章 绪论
• 1.1 药物基因组学与个体化治疗概述
• 1.1.1 药物基因组学的研究内容
• 1.1.2 基因多态性与药物效应的多样性
• 1.1.3 药物基因组学在合理用药中的应用
• 1.2 EGFR的结构功能及分子靶向治疗的进展
• 1.2.1 非小细胞肺癌概述
• 1.2.2 EGFR的结构功能
• 1.2.3 EGFR基因突变与吉非替尼治疗非小细胞肺癌进展
• 1.3 EGFR基因突变检测方法的研究进展
• 1.3.1 单核苷酸多态性的意义及检测方法
• 1.3.2 EGFR基因突变性检测方法
• 1.4 立题背景与意义
• 第二章 EGFR基因突变检测方法的建立
• 2.1 EGFR检测方法的总体设计
• 2.2 检测探针的设计方法
• 2.2.1 模板扩增PCR引物
• 2.2.2 连接反应探针的设计
• 2.2.3 连接产物的扩增反应
• 2.3 结果
• 2.3.1 琼脂糖凝胶电泳检测
• 2.3.2 Qubit定量系统检测
• 2.3.3 通用寡核苷酸芯片检测方法
• 2.4 讨论
• 第三章 EGFR基因突变的检测方法摸索及优化
• 3.1 材料
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 主要溶液
• 3.1.4 主要仪器
• 3.1.5 探针的溶解及保存
• 3.2 方法
• 3.2.1 样本基因组DNA的提取
• 3.2.2 EGFR基因突变检测方法实验流程
• 3.3 检测方法的条件优化
• 3.3.1 关于聚合连接反应退火温度的优化
• 3.3.2 关于聚合连接反应探针量的优化
• 3.3.3 关于两步消化反应的优化
• 3.3.4 关于聚合酶的选择以及使用量的优化
• 3.3.5 关于P3、p4引物量的优化
• 3.4 检测结果的展示
• 3.4.1 琼脂糖凝胶电泳检测EGFR单核苷酸多态性
• 3.4.2 Qubit定量系统检测EGFR单核苷酸多态性
• 3.4.3 通用寡核苷酸芯片检测方法
• 3.5 讨论
• 第四章 定点突变克隆各个SNP位点
• 4.1 材料
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 主要试剂
• 4.1.3 主要溶液
• 4.1.4 培养基
• 4.1.5 主要仪器
• 4.1.6 探针的保存及溶解
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 定点突变的原理
• 4.2.2 具体实验流程
• 4.3 结果
• 4.4 讨论
• 第五章 检测限的确立及检测非小细胞肺癌病人样本
• 5.1 材料
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 主要试剂
• 5.1.3 主要溶液
• 5.1.4 主要仪器
• 5.2 灵敏度的检测
• 5.3 临床非小细胞肺癌样本的检测
• 5.4 讨论
• 全文小结
• 参考文献
• 致谢