论文摘要
目的:多药耐药（Multidrug resistance, MDR）是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物出现耐药的同时,对其他结构不同、作用靶位不同的抗肿瘤药物也产生抗药性的现象。MDR的发生是造成化疗失败的重要原因。所以,开发研究效果好、副作用小的肿瘤多药耐药逆转剂,可对化疗药物抗肿瘤作用的发挥有重要作用;本课题研究了中药昆布提取物（Thallus Laminariae PE,TLPE）对人子宫内膜癌耐药细胞株B-MD-C1（ADR+/+）耐药性的逆转作用及其分子学机制,为开发中药肿瘤多药耐药逆转剂提供科学依据。方法:1采用MTT法测定B-MD-C1（ADR+/+）耐药细胞株的耐药倍数,是否符合实验条件。2采用免疫细胞化学方法（SP法）、流式细胞术（FCM）检测耐药细胞株B-MD-C1（ADR+/+）和敏感细胞株B-MD-C1（wt）细胞内的P-gp表达,比较两者耐药性是否具有显著性差异。3 MTT法测定昆布水提物的细胞毒性,检测耐药[B-MD-C1（ADR+/+）]和敏感[B-MD-C1（wt）]细胞对TLPE的敏感性,由此选出TLPE的无毒剂量和低毒剂量作为逆转耐药的剂量进行下述实验。4 MTT法测定经昆布水提物干预后,细胞株对ADM耐药性的变化,测定细胞能否逆转多药耐药性;免疫细胞化学法（SP法）检测细胞内P-gp的表达变化。5流式细胞仪检测昆布水提物干预后细胞内ADM浓度聚集的变化,用于检测P-gp的功能变化。6流式细胞术测定经昆布水提物干预后,B-MD-C1（ADR+/+）的细胞周期变化和凋亡情况。7姬姆萨染色技术观察经昆布水提物干预后,B-MD-C1（ADR+/+）细胞的形态学变化。8流式细胞技术测定经昆布水提物干预后,B-MD-C1（ADR+/+）细胞内的PKC-α和GST-π水平的变化。9 RT-PCR检测经昆布水提物干预后, B-MD-C1（ADR+/+）细胞mdr1 mRNA水平表达情况。10比色法测定经昆布水提物干预后,细胞ATP酶表达水平的变化,探讨昆布水提物对P-gp功能影响的机制。结果:1耐药细胞株B-MD-C1（ADR+/+）与其亲本细胞B-MD-C1（wt,非耐药细胞）相比,对ADM的耐药性高31倍左右,且P-gp的表达明显增高,有非常显著性差异（P<0.01）。2 TLPE对B-MD-C1（ADR+/+）细胞和B-MD-C1（wt）细胞的IC50值:⑴TLPE作用相同时间后（24h、48h、72h）,对两细胞株之间IC50值无明显差别（P>0.05）;⑵TLPE作用相同时间后（72h）,对两细胞株的无毒和低毒剂量均分别为70μg/ml和125μg/ml,剂量范围无差别（P>0.05）。说明B-MD-C1（ADR+/+）和B-MD-C1（wt）细胞对TLPE的敏感性相同。3 ADM对B-MD-C1（ADR+/+）细胞的IC50有所降低,但仍高于敏感细胞株B-MD-C1（wt）;细胞内的P-gp表达水平明显降低（P<0.01）,但仍高于亲本细胞。提示,TLPE可明显逆转B-MD-C1（ADR+/+）细胞对MDR的敏感性,但并非完全逆转。另外,TLPE逆转细胞耐药性及下调细胞P-gp表达的作用,随TLPE剂量的增加和作用时间的延长而增强,提示TLPE对细胞的耐药逆转作用呈剂量和时间依赖性。4经TLPE干预后,耐药细胞内ADM浓度于未处理组细胞相比明显增加（P<0.01）,表明TLPE降低了P-gp泵对药物的外排作用。5 TLPE干预后:①不同浓度TLPE干预不同时间后的B-MD-C1（ADR+/+）细胞生长稳定,各细胞周期的细胞比例及细胞凋亡率无差异（P>0.05）;②但与未处理组细胞相比,TLPE能将细胞周期阻滞于S期（P<0.01）,其作用随TLPE剂量增加、作用时间延长而增大,而细胞凋亡率无明显变化（P>0.05）。6经TLPE干预后,B-MD-C1（ADR+/+）细胞的形态发生显著变化（P<0.01）,表现为细胞体积缩小,染色质浓缩、边集等现象。该现象与细胞被阻滞于S期的结果相吻合。7 TLPE干预后,B-MD-C1（ADR+/+）细胞中PKC-α和GST-π的表达水平明显降低,与对照组相比有明显差异（P<0.01）,其降低程度与TLPE的剂量和作用时间相关,说明TLPE逆转细胞的耐药性可能通过降低PKC-α和GST-π的表达,直接或间接的影响了P-gp表达。8 TLPE干预后,能够降低B-MD-C1（ADR+/+）细胞mdr1mRNA的表达（P<0.01）,减少了对ADM的外排作用,从而提高肿瘤细胞内化疗药物浓度,达到逆转作用。9 TLPE干预后,B-MD-C1（ADR+/+）细胞的ATPase表达无明显变化（P>0.05）。说明TLPE影响P-gp的功能可能不是通过影响ATPase来实现的。结论:1人子宫内膜癌耐药细胞株B-MD-C1（ADR+/+）具有明显的耐药性,其耐药机制之一是细胞内P-gp的高表达。2 TLPE对B-MD-C1（ADR+/+）和B-MD-C1（wt）细胞间增殖反应的影响无明显差异,但TLPE能将B-MD-C1（ADR+/+）和B-MD-C1（wt）细胞阻滞于S期,其效应呈剂量和时间依赖性,但不诱导细胞凋亡。3 TLPE对B-MD-C1（ADR+/+）细胞有耐药逆转作用,并呈现剂量和时间依赖性;其作用机制可能是通过下调P-gp的表达和降低P-gp的功能,降低耐药细胞mdr1mRNA的表达有关,可能与PKC-α和GST-π的降低相关;但与ATPase的变化无关。