乙内酰脲酶的基因表达及菌种筛选

论文题目: 乙内酰脲酶的基因表达及菌种筛选

论文类型: 硕士论文

论文专业: 微生物与生化药学

作者: 王婕

导师: 刘党生,张惟材

关键词: 乙内酰脲水解酶,氨甲酰化酶,表达,筛选

文献来源: 沈阳药科大学

发表年度: 2005

论文摘要: 乙内酰脲酶是一类用于手性氨基酸生产的酶。本研究包括L-乙内酰脲酶和D-乙内酰脲酶两个部分研究。 建立了一个可行的筛选模型，从不同地区采集土样，利用5-对羟基苯基乙内酰脲为惟一氮源进行土样富集，在筛选平板上经过初筛后，获得49株候选菌株，通过检测中间产物和终产物进行复筛，结果筛选得到1株活性最强的产酶菌株BT821。该菌能将DL-对羟基苯基乙内酰脲不对称水解为D-对羟基苯甘氨酸。 通过化学合成和基因拼接方法获得了编码一种耐热D-乙内酰脲酶的基因，并对其活性做了初步研究，结果表明，该D-乙内酰脲水解酶活性在55℃下比在37℃时更高。 通过PCR获得编码硫氧还蛋白结构基因，置T5启动子之下，再连接至低拷贝质粒pOK12上，构建得到能够单独表达硫氧还蛋白且与pUC或pQE质粒相容的质粒。利用双质粒系统同时表达目的蛋白和伴侣分子硫氧还蛋白，可实现目的蛋白的可溶表达，减少包涵体形成。 通过PCR扩增得到BT811的D-乙内酰脲水解酶和D-氨甲酰化酶的结构基因，分别置于表达载体pT221（含有一种分子伴侣的质粒）的T7和pQE60的T5启动子下游构成表达质粒pT221-hyuH和pQE60-hyuC，并分别在大肠杆菌BL21（DE3）和JM109中实现了两个基因的表达。SDS-PAGE检测表达产物，在相对分子量53kD和45kD处分别有一表达带，与BT811的D-乙内酰脲水解酶和D-氨甲酰化酶的一级结构预测分子量53.0kD和45.2kDa相符。通过PCR扩增得到BT801 L-氨甲酰化酶的结构基因，将该基因置于原核表达载体pQE60的强启动子T5启动子控制之下，加上组氨酸标签，实现了该酶在大肠杆菌JM109中的表达，SDS-PAGE结果显示在44KD处有表达带，这与氨甲酰化酶的一级结构预测分子量相符（44413 D）。纯化了该酶，纯化后的酶是初始菌活性的144倍。用100mmol／L的NaHCO3和100μmol／L的Co2+对BT801的L-乙内酰脲水解酶进行了激活。

论文目录:

目录

摘要

Abstract

前言

第一章 D-乙内酰脲酶产酶新菌株的筛选

1 材料

1.1 底物和培养基：

1.2 试剂

1.3 仪器

2 方法

2.1 酶活性的定性检测：采用薄层层析法(TLC)。

2.2 革兰氏染色方法

3 结果

3.1 菌种筛选模型的建立

3.2 菌种的筛选

3.3 菌种的鉴定

4 讨论

第二章 耐热的D-乙内酰脲水解酶基因合成

1 材料

1.1 菌种和质粒

1.2 工具酶及试剂盒

1.3 引物

1.4 试剂

1.5 主要仪器

2 方法

2.1 PCR连接基因

2.2 质粒pQE60S-hyuC的构建、转化与克隆菌株的鉴定

2.3 质粒pQE60S-SD1的构建、转化与克隆菌株的鉴定

2.4 阳性克隆的检测

2.5 乙内酰脲水解酶活性的检测

2.6 乙内酰脲水解酶活力的测定

2.7 定点突变纠正错误碱基

3 结果

3.1 乙内酰脲水解酶基因的PCR连接

3.2 错误碱基的定点突变

3.3 表达质粒pQE60S-hyuC的构建、转化与克隆菌株的鉴定

3.4 pQE60S-hyuC表达产物的SDS-PAGE检测

3.5 DH5α／pQE60S-hyuC表达产物的生物学活性分析

3.6 表达质粒pQE60S-SD1的构建、转化与克隆菌株的鉴定

3.7 pQE60S-SD1的表达产物SDS-PAGE检测

3.8 表达产物的生物学活性分析

3.9 表达产物的生物活性定量分析

4 讨论

第三章 分子伴侣共表达的载体构建

1 材料

1.1 菌种和质粒

1.2 工具酶及试剂盒

1.3 试剂

2 方法

2.1 PCR扩增Trx基因

2.2 表达质粒pQE60-Trx的构建、转化与克隆菌株的鉴定

2.3 表达质粒pOK12-Trx的构建、转化与克隆菌株的鉴定

2.4 阳性克隆的检测

3 结果

3.1 Trx基因的PCR扩增

3.2 表达质粒pQE60-Trx的构建、转化与克隆菌株的鉴定

3.3 Trx基因表达产物的SDS-PAGE检测

3.4 表达质粒pOK12-Trx的构建、转化与克隆菌株的鉴定

3.5 Trx基因和乙内酰脲水解酶基因共表达的SDS-PAGE检测

4 讨论

第四章 乙内酰脲酶的表达、纯化和激活

1 材料

1.1 菌株和质粒

1.2 培养基

1.3 工具酶和试剂盒

1.4 试剂

1.5 主要溶液

1.6 离子交换柱：DEAE Sepharose Fast Flow柱及Q Sepharose High Performance柱

1.7 PCR引物

2 方法

2.1 PCR扩增基因

2.2 外源DNA与质粒载体的连接反应

2.3 连接产物转化大肠杆菌感受态细胞

2.4 表达质粒pT221-hyuH的构建、转化与克隆菌株的鉴定

2.5 表达质粒pQE60-hyuC~D的构建、转化与克隆菌株的鉴定

2.6 表达质粒pQE60-hyuC~L的构建、转化与克隆菌株的鉴定

2.7 阳性克隆的检测

2.8 诱导表达

2.9 表达产物SDS-PAGE分析

2.10 表达产物的可溶性分析

2.11 乙内酰脲水解酶活性的检测

2.12 乙内酰脲水解酶活力的测定

2.13 氨甲酰化酶活性的测定

2.14 氨甲酰化酶活力的测定

2.15 氨基酸的比色测定

2.16 菌体蛋白含量的测定

2.17 硫酸铵沉淀

2.18 透析膜的处理

2.19 表达蛋白可溶性部分的纯化

3 结果

3.1 D-乙内酰脲水解酶和D-氨甲酰化酶基因的PCR扩增

3.2 表达质粒pT221-hyuH的构建、转化与克隆菌株的鉴定

3.3 D-hyuH基因表达产物的SDS-PAGE检测

3.4 表达质粒pQE60-hyuC~D的构建、转化与克隆菌株的鉴定

3.5 D-hyuC基因表达产物的SDS-PAGE检测

3.6 BL21(DE3)／pT221-hyuH和JM109／pQE60-hyuC~D表达产物的生物活性定性分析

3.7 BL21(DE3)／pT221-hyuH和JM109／pQE60-hyuC~D表达产物的生物活性定量分析

3.8 L-hyuC基因的PCR扩增

3.9 表达质粒pQE60-hyuC~L的构建、转化和克隆菌株的鉴定

3.10 L-hyuC基因表达产物的SDS-PAGE检测

3.11 L-氨甲酰化酶的纯化

3.12 JM109／pQE60-hyuC~L表达产物的生物活性定量分析

3.13 BT801L-乙内酰脲水解酶的激活

4 讨论

结论

英文缩写表

参考文献

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致谢

发布时间: 2006-11-27

参考文献

• [1].N-乙酰基-3，4-二甲氧基苯基丙氨酸合成工艺的研究[D]. 刘永太.山东大学2005
• [2].异恶唑取代脯氨酸并（硫代）乙内酰脲的液相合成[D]. 许发达.浙江大学2006
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• [4].5-（烷基氨基）乙内酰脲衍生物的合成及生物活性研究[D]. 黄刚.华中师范大学2007

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