在未分化的人骨髓间充质干细胞内鉴定调节Nanog基因表达的顺式调控元件

论文摘要

骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,骨髓MSCs）具有自我扩增和多向分化潜能,具有易分离、扩增快以及体外操作简便等特点,使其在组织工程、细胞移植、基因治疗等领域具有十分广阔的应用前景。目前对骨髓MSCs生长调节机理研究的很少,很有必要深入研究骨髓MSCs的自我更新机制。本论文试图鉴定调节Nanog基因表达的顺式调控元件,并且研究关键转录因子Oct4和Sox2在调节Nanog基因表达中的作用。双荧光报告素酶实验表明,在未分化的人骨髓MSCs中,Nanog基因片段（自-380bp至+24bp）能够被激活,能够活化报告基因萤火虫荧光素酶的表达,但在由骨髓MSCs诱导分化的成骨细胞中,此Nanog基因片段不能被激活。另外,将含有绿色荧光蛋白报告基因的质粒转染入细胞内后,在未分化的人骨髓MSCs中,此Nanog基因片段能够活化绿色荧光蛋白的表达。这些研究结果表明此Nanog基因片段（自-380bp至+24bp）含有顺式调控元件,能够在未分化的人骨髓MSCs中被激活。RT-PCR研究表明,未分化的人骨髓MSCs能够表达Oct4基因,并且能够表达少量Sox2,但由骨髓MSCs诱导分化的成骨细胞不能表达Oct4和Sox2。上述Nanog基因片段（自-380bp至+24bp）含有可与转录因子Oct4和Sox2结合的核苷酸顺序,凝胶迁移实验显示,在未分化的人骨髓MSCs中,转录因子Oct4和Sox2不能够与此核苷酸顺序结合,说明虽然Oct4和Sox2基因能够在未分化的人骨髓MSCs内表达,转录因子Oct4和Sox2可能不能在此细胞内调节Nanog基因的表达。在未分化的胚胎干细胞（embryonic stem cells）中,Oct4和Sox2对Nanog基因的表达起到重要作用,此研究表明,与胚胎干细胞不同,Oct4和Sox2在未分化的人骨髓MSCs内不能够活化Nanog基因,其他的未知转录因子可能能够活化Nanog基因的表达。本实验的结果具有重要的理论和应用价值,为进一步研究人骨髓MSCs的自我更新及分化机制提供了依据,不但有利于促进MSCs生长,也有利于控制MSCs的定向分化,有利于将MSCs应用于组织工程。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 主要符号对照表
• 第一章 前言
• 1.1 骨髓MSCs概述
• 1.1.1 骨髓MSCs的分离和培养
• 1.1.2 骨髓MSCs的生物学特性
• 1.1.3 骨髓MSCs的体外成骨诱导分化
• 1.2 转录因子Oct4 与Nanog在ES细胞中的调控研究
• 1.2.1. Nanog与干细胞
• 1.2.2. Oct4 与干细胞
• 1.3 研究背景，目的和意义
• 第二章 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 主要试剂和原料
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.1.3 常用溶液及其配制
• 2.1.4 菌种和细胞株
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 人骨髓MSCs原代细胞的分离培养
• 2.2.2 人骨髓MSCs的保存和复苏
• 2.2.3 人骨髓MSCs的鉴定
• 2.2.4 诱导人骨髓MSCs分化成成骨细胞
• 2.2.5 成骨细胞分化鉴定
• 2.2.6 人基因组DNA的提取
• 2.2.7 制备感受态细胞
• 2.2.8 小量抽提质粒
• 2.2.9 中量抽提质粒
• 2.2.10 纯化DNA
• 2.2.11 DNA凝胶回收
• 2.2.12 质粒转化
• 2.2.13 双荧光报告素酶报告质粒的构建
• 2.2.14 绿色荧光蛋白报告质粒的构建
• 2.2.15 脂质体转染
• 2.2.16 双荧光素酶报告实验
• 2.2.17 总RNA提取
• 2.2.18. RT-PCR检测Oct4 和Sox2 表达情况
• 2.2.19 绿色荧光蛋白实验
• 2.2.20 核蛋白提取
• 2.2.21 生物素标记探针
• 2.2.22 斑点杂交检测探针标记效率
• 2.2.23 凝胶电泳迁移率实验
• 第三章 实验结果
• 3.1 人骨髓MSCs的原代培养
• 3.2 人骨髓MSCs的鉴定
• 3.3 成骨细胞分化鉴定
• 3.4 提取人基因组DNA
• 3.5 双荧光素酶检测Nanog调控元件在骨髓MSCs内的活性
• 3.6 绿色荧光蛋白实验检测Nanog调控元件在骨髓MSCs内的活性
• 3.7 RT-PCR检测Oct4 和Sox2 表达情况
• 3.8 斑点杂交检测探针标记效率
• 3.9 EMSA检测Oct4 与Sox2 是否激活Nanog顺式调控元件
• 第四章 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果