论文摘要
目的：研究桦褐孔菌抗突变活性成分inotodiol对人肺癌A549细胞株的诱导凋亡和抗增殖作用及其机制的实验研究，为开发高效抗肿瘤新药提供实验和理论依据。方法：应用MTT法测定桦褐孔菌抗突变活性成分对人肺癌A549细胞株的生长抑制作用；通过倒置显微镜、HE染色光学显微镜、吖碇橙（AO）／溴化乙啶（EB）染色荧光显微镜及透射电子显微镜技术观察肿瘤细胞凋亡的形态学变化；应用生物化学TUNEL法检测细胞凋亡率，应用流式细胞术检测细胞凋亡定量分析和细胞周期的变化；应用免疫细胞化学技术检测药物处理前后增殖细胞核抗原Ki-67及凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Caspase-9、Caspase-3、p53、Fas及FasL的基因蛋白表达。结果：MTT法检测结果，20，40，80mg／L桦褐孔菌抗突变活性成分在体外对人肺癌A549细胞株有明显的抑制生长的作用，且呈现出浓度和时间的依赖性。倒置显微镜观察结果，实验组肿瘤细胞体积变小、变圆，核染色质凝集，细胞间连接疏松，贴壁能力减弱；HE染色观察结果，实验组肿瘤细胞体积变小、变圆，核染色质浓缩或染色质块形成，有的细胞膜起泡形成凋亡小体：AO／EB荧光染色观察结果，实验组肿瘤细胞核染色质呈橘红色，胞质内的橘红色或橘黄色荧光消失，细胞周围呈亮绿色的凋亡小体：透射电镜观察结果，实验组肿瘤细胞核染色质固缩、边集，胞质内可见有空泡，也可见凋亡小体凸出于细胞表面。生物化学TUNEL染色法检测结果，药物在20mg／L时就能诱导肺癌A549细胞株凋亡，肿瘤细胞凋亡率随作用时间的延长而上升，显示明显的时效关系，当药物作用48h其AI达高峰；免疫细胞化学ki-67抗原检测结果，ki-67阳性表达率随药物浓度的提高和作用时间的延长而降低，表现出浓度和时间的依赖性关系；流式细胞仪检测结果，实验组凋亡率明显增加，当20μg／ml桦褐孔菌抗突变活性成分处理24、48h时，细胞出现了凋亡峰，凋亡率分别为18.41％、36.12％，不同作用时间相比差异均有统计学意义（P＜0.01），G0／G1期和G2／M期细胞百分比下降，而S期细胞百分比上升，表明肿瘤细胞在S期聚积，阻滞了向G2／G0期的转换，从而影响细胞周期；凋亡相关基因表达检测结果，实验组Bcl-2基因蛋白阳性表达率明显降低，而Bax、Caspase-9、Caspase-3、p53、Fas及FasL基因蛋白阳性表达率明显升高。结论：1)桦褐孔菌抗突变活性成分在体外对人肺癌A549细胞株有抑制增殖作用，呈明显的量效和时效关系。2)经凋亡形态学、生物化学及流式细胞仪结果分析，桦褐孔菌抗突变活性成分作用于人肺癌A549细胞株后诱导肿瘤细胞的凋亡。3)桦褐孔菌抗突变活性成分通过干扰细胞周期抑制人肺癌A549细胞的生长，主要阻滞细胞周期的S期。4)桦褐孔菌抗突变活性成分可能是通过下调Bcl-2，上调Bax基因蛋白的表达而诱导肿瘤细胞的凋亡，与启动Caspase-9、Caspase-3的凋亡信号有关，并通过细胞凋亡的线粒体途径和死亡受体途径来完成凋亡的启动和执行。