论文摘要
第一部分小鼠骨髓来源树突状细胞的改良培养目的:运用改良方法,简单、经济地从小鼠骨髓诱导和扩增得到大量高纯度树突状细胞（DCs）。方法:梯度密度离心法从小鼠骨髓分离得到单个核细胞,低密度接种骨髓单个核细胞于24孔板,加入含rmGM-CSF 10 ng/ml和rmIL-4 5 ng/ml的RPMI1640全培养基培养68d,LPS刺激成熟。光镜、扫描电镜观察细胞形态、流式细胞术（FCM）检测细胞特异性表面标志、单向混合淋巴细胞反应（MLR）鉴定细胞刺激同种异体淋巴细胞的能力、酶联免疫吸附实验（ELISA）检测细胞培养上清中IL-12释放水平。结果:每只小鼠骨髓约可得到2×107个DCs,细胞呈典型的树突状突起,高表达特异性表面标志物CD11c（90.01 %）,高表达MHCⅡ类分子、CD86、CD80、CD40及CCR7,具有较强的促进T细胞增殖功能与释放IL-12能力。结论:方法改良后可简单从小鼠骨髓获得高纯度、具有功能的树突状细胞。第二部分CTLA4Ig修饰的树突状细胞体外对Th亚群分化的影响目的:探讨细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白（CTLA4Ig）修饰的树突状细胞（DC-CTLA4Ig）体外对Th亚群分化的影响。方法:通过重组腺病毒载体将目的基因（CTLA4Ig）转染至小鼠骨髓来源的DCs。采用FCM检测细胞表面分子和胞内CTLA4Ig的表达;MLR检测DCs刺激同种异体T细胞的能力,ELISA法检测抗原提呈反应共培养体系中细胞因子IFN-γ、IL-4和IL-10的分泌水平,FCM检测该共培养体系中Th1,Th2及Treg水平。结果:CTLA4 Ig基因成功转染至DCs,转染率约为80 %,制备的DC-CTLA4Ig稳定表达CTLA4Ig,表面分子CD86呈现低表达;与对照组相比,DC-CTLA4Ig有效抑制T细胞增殖,降低共培养上清中IFN-γ和IL-4的分泌水平,增加IL-10分泌,使IFN-γ/IL-4比值亦有所上升;DC-CTLA4Ig虽使共培养体系中Th1及Th2水平同时降低,但Th1/Th2比值增加; DC-CTLA4Ig可上调Treg水平,并降低Th2/Treg比值。结论:通过腺病毒将CTLA4Ig基因转染DCs并且高效表达,可有效降低DCs表面CD86分子,抑制同种异体T细胞反应,并能影响体外Th1/Th2和Th2/Treg水平。第三部分激发阶段回输DC-CTAL4Ig对哮喘小鼠气道炎症及Th失衡的干预作用目的:研究建模激发阶段回输DC-CTLA4Ig对哮喘小鼠气道炎症及气道高反应性的治疗作用并观察其可能机制。方法:SPF级BALB/c小鼠90只,随机分为正常对照组、哮喘模型组、DC-GFP对照组和DCs对照组和DC-CTLA4Ig干预组。哮喘模型组用OVA致敏和激发;正常对照组用磷酸盐缓冲液（PBS）代替;DC-GFP对照组、DCs对照组和DC-CTLA4Ig干预组于首次激发前30 min分别回输DC-GFP、DCs和DC-CTLA4Ig,余处理同模型组。观察小鼠哮喘发作情况,肺组织病理切片检测气道炎症,体描法检测小鼠气道高反应性,检测支气管肺泡灌洗液（BALF）中白细胞总数及分类,ELISA法检测BALF和血清中细胞因子IFN-γ,IL-4和IL-10的水平,FCM检测肺和脾脏Th1,Th2和Treg水平。结果:与哮喘模型组、DC-GFP对照组和DCs对照组小鼠比较,DC-CTLA4Ig激发期尾静脉回输可明显减轻小鼠的急性哮喘发作症状;减轻气道炎症和嗜酸性粒细胞浸润;降低小鼠气道高反应性;降低气道局部IL-4水平,增加IFN-γ和IL-10水平;降低肺部Th2比例,增加肺部Th1和Treg比例;但对血清中细胞因子水平和脾脏Th亚群无明显调节作用。结论:激发期尾静脉回输DC-CTLA4Ig可明显减轻小鼠急性哮喘发作症状,减轻气道炎症,降低气道高反应性,而其可能机制与降低气道局部Th2细胞因子分泌,增加气道局部Th1细胞因子分泌,纠正气道局部Th1/ Th2和Th2/Treg失衡有关。第四部分致敏阶段回输DC-CTAL4Ig对哮喘小鼠气道炎症及Th失衡的干预作用目的:研究致敏阶段回输DC-CTLA4Ig对哮喘小鼠气道炎症及气道高反应性的防治作用及其可能机制。方法:SPF级BALB/c小鼠90只,随机分为正常对照组、哮喘模型组、DC-GFP对照组和DCs对照组和DC-CTLA4Ig干预组。哮喘模型组用OVA致敏和激发;正常对照组用生理盐水代替;DC-GFP对照组、DCs对照组和DC-CTLA4Ig干预组于0、14d致敏前30 min分别回输DC-GFP、DCs和DC-CTLA4Ig,余处理同模型组。观察小鼠哮喘发作情况,肺组织病理切片检测气道炎症,体描法检测小鼠气道高反应性,检测BALF中白细胞总数及分类,ELISA法检测BALF和血清中细胞因子IFN-γ,IL-4和IL-10的水平, FACS检测肺和脾脏Th1,Th2和Treg水平。结果:与哮喘模型组、DC-GFP对照组和DCs对照组小鼠比较,致敏期尾静脉回输DC-CTLA4Ig可明显减轻小鼠的急性哮喘发作症状;减轻气道炎症和嗜酸性粒细胞浸润;降低小鼠气道高反应性;降低气道局部IL-4水平,增加IFN-γ和IL-10水平;降低肺部Th2比例,增加肺部Th1和Treg比例;但对血清中细胞因子水平和脾脏Th亚群无明显调节作用。结论:致敏期尾静脉回输DC-CTLA4Ig可明显减轻小鼠急性哮喘发作症状,减轻气道炎症,降低气道高反应性,而其机制与降低气道局部Th2细胞因子分泌,增加气道局部Th1细胞因子分泌,纠正气道局部Th1/ Th2和Th2/Treg失衡有关。
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