蝗虫精氨酸激酶基因的克隆、表达、纯化及酶学性质研究

论文摘要

精氨酸激酶（Arginine Kinase, AK）（ATP:Arginine N-phosphotransferase EC 2.7.3.3）属于磷酸原激酶家族中的重要一员,广泛的存在于无脊椎动物及软体动物中,起着类似于脊椎动物中肌酸激酶（Creatine Kinase,CK）（ATP:Creatine N-phosphotransferase EC 2.7.3.2）的作用,是一个与细胞内能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶。磷酸原激酶家族是一个保守家族,可逆催化肌酸或精氨酸与ATP之间的转磷酰基反应,形成的高能磷酸化的磷酸肌酸或磷酸精氨酸称为磷酸原。本研究对蝗虫精氨酸激酶进行了克隆、表达以及分离纯化,在此基础上,进一步研究了精氨酸激酶的基本酶学性质、酶的催化机制、底物结合协同性、点突变对其活性、结构和稳定性的影响、酶的表达调节机制以及抑制剂的抑制机理,旨在为开发以精氨酸激酶为靶标的新型害虫抑制剂提供理论依据。本试验的主要结果如下:1.精氨酸激酶基因的克隆利用同源序列设计简并引物,通过RT-PCR的方法从蝗虫腿肌中克隆到精氨酸激酶基因的中间片段,通过5’-RACE和3’-RACE分别克隆到5’和3’片段,拼接后设计特异引物扩增到全长cDNA,命名为LmmAK （DQ513322）。该基因全长为2014 bp,ORF为1068 bp,编码355个氨基酸,分子量约为40 kD。同源性分析表明LmmAK有两个序列保守的结构域,其中第一个结构域,即GS结构域是与底物结合协同性有关的氨基酸,研究表明Y75和P272在底物结合协同性方面起关键作用。第二个结构域,即磷酸源激酶的保守结构域包括“C-P-（S/T）-N-（I/L）-G-T”等保守的氨基酸。2.精氨酸激酶的表达和分离纯化将精氨酸激酶的基因连接到原核表达载体pET-30a和pET-28a上并转入大肠杆菌中进行原核表达。当用原核表达载体pET-30a进行表达时,得到包涵体形式存在的精氨酸激酶,通过变性复性的方法可以得到活性的精氨酸激酶,在变性复性体系中加入小分子物质SDS和Tween能提高蛋白质复性的效率。当用pET-28a进行原核表达时,通过改变诱导条件得到了以可溶性形式存在的有功能的精氨酸激酶,通过改进的纯化方法和Sephadex G-75排阻层析方法相结合可以纯化得到精氨酸激酶,最终的回收率为90 %。3.重组精氨酸激酶的酶学性质通过包涵体变性复性方法获得的精氨酸激酶和通过活性形式分离纯化得到的精氨酸激酶的动力学参数与从蝗虫腿肌中直接分离得到的酶的参数相同。这些参数包括底物的分离常数、米氏常数、酶的比活力、酶的泳动性和酶的等电点等。通过与来源于蟑螂、海蟹的精氨酸激酶的参数的比较我们发现蝗虫的精氨酸激酶具有最高的底物亲和力和较强的底物结合协同性。4.精氨酸激酶的底物结合协同性有关的氨基酸通过定点突变的方法获得一系列精氨酸激酶的突变体来研究与底物结合协同性有关的的氨基酸位点。突变体Y75F和Y75D表现较强的底物结合协同性（Kd/Km = 6.2-13.4）,然而单突变P272G和P272R以及双突变Y75F/P272G的底物结合协同性几乎完全丧失（Kd/Km = 1.1-1.4）,另一个双突变体Y75D/P272R具有与野生型酶的相同的酶学性质。所有的结果表明75位和272位的氨基酸在精氨酸激酶的底物结合协同性方面起关键的作用。光谱学和酶动力学研究的结果为底物结合协同性的改变与酶空间结构存在微妙的关系提供了一个直接的证据。5.脯氨酸（P272）对精氨酸激酶的活性、空间结构及稳定性的影响脯氨酸（P272）位点虽不位于酶的活性中心部位,但是它在维持酶的稳定性和酶的活性方面起重要作用。该位点的突变引起酶的空间结构的改变导致酶形成部分折叠的、具有活性的和有更多疏水区暴露酶,这种酶在高温等极端环境中易于聚沉而沉淀。该位点的突变影响了酶从熔球态中间体向活性酶的折叠过程。以上结果说明某些靠近活性中心的氨基酸可能在维持酶的正确的空间结构和保持酶的活性方面起关键作用。6.精氨酸激酶的表达调控模式对蝗虫生长过程中精氨酸激酶的蛋白含量、酶的比活力和mRNA的含量研究表明:酶的蛋白含量和酶的比活力随着蝗虫的增长而稳定增加,但是在mRNA的水平上其含量变化却很少,这种结果表明精氨酸激酶的表达调控模式应该是转录后调控。初步结果表明蝗虫的精氨酸激酶的表达调控主要在转录后调控的水平上,主要包括mRNA的成熟、mRNA的稳定性和mRNA的翻译等方面。

论文目录

• 英文缩略词
• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 精氨酸激酶的生物学功能
• 1.2 精氨酸激酶的分子生物学
• 1.3 精氨酸激酶表达调控研究
• 1.4 精氨酸激酶底物结合的协同作用
• 1.5 精氨酸激酶的折叠和去折叠
• 1.5.1 蛋白质折叠的主要假说和模型
• 1.5.1.1 框架模型
• 1.5.1.2 疏水塌缩模型
• 1.5.1.3 扩散-碰撞-粘合机制
• 1.5.1.4 成核-凝聚-生长模型
• 1.5.2 蛋白质的体外折叠
• 1.5.3 蛋白质去折叠的研究
• 1.6 精氨酸激酶的晶体结构和空间结构模拟
• 1.6.1 精氨酸激酶的晶体结构
• 1.6.2 精氨酸激酶的空间结构模拟
• 1.7 本研究的科学意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 生物材料
• 2.1.2 菌株与质粒
• 2.1.3 酶及生化试剂
• 2.1.4 PCR 引物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 总RNA 的提取
• 2.2.2 cDNA 第一条链的合成
• 2.2.3 cDNA 纯化
• 2.2.4 对cDNA 进行末端加尾
• 2.2.5 精氨酸激酶基因全长的克隆
• 2.2.5.1 中间片段的获得
• 2.2.5.2 通过5’RACE 获得5’端序列
• 2.2.5.3 通过3’RACE 获得3’端序列
• 2.2.5.4 精氨酸激酶基因全长的克隆
• 2.2.6 精氨酸激酶的原核表达
• 2.2.6.1 原核表达载体的构建
• 2.2.6.2 连接
• 2.2.6.3 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.6.4 转化及克隆筛选
• 2.2.6.5 碱法小量提取质粒DNA
• 2.2.6.6 质粒DNA 的酶切鉴定
• 2.2.6.7 回收
• 2.2.6.8 DNA 序列测定
• 2.2.6.9 E.coli BL21 的原核表达
• 2.2.6.10 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.7 原核表达精氨酸激酶的纯化
• 2.7.1 蛋白质含量的测定
• 2.7.2 酶活力测定方法
• 2.7.3 原核表达活性AK 的纯化
• 2.7.3.1 粗酶液的制备
• 2.7.3.2 分子筛层析和离子交换层析纯化
• 2.7.3.3 亲和层析方法纯化原核表达活性AK
• 2.7.3 4 原核表达包涵体AK 的纯化及复性
• 2.7.3.5 精氨酸激酶纯度的鉴定及分子量的测定
• 2.7.3.6 抗体的制备
• 2.7.3.7 抗血清效价的测定
• 2.7.3.8 Western 杂交
• 2.8 精氨酸激酶关键位点的定点突变
• 2.9 突变精氨酸激酶的原核表达和分离纯化
• 2.10 精氨酸激酶的酶学性质的研究
• 2.10.1 精氨酸激酶的动力学特性
• 2.10.1.1 酶浓度对酶促反应速率的影响
• 2.10.1.2 米氏常数Km 及其它动力学参数的测定
• 2.10.1.3 酶反应最适pH 的测定
• 2.10.1.4 酶最适温度的测定
• 2.11.1 精氨酸激酶等电点及荧光发射光谱测定
• 2.11.2 精氨酸激酶外源荧光光谱测定
• 2.12 精氨酸激酶的热变性和热聚沉
• 2.13 盐酸胍诱导的精氨酸激酶的失活
• 2.14 盐酸胍浓度依赖的精氨酸激酶的折叠和去折叠
• 2.14.1 精氨酸激酶折叠和去折叠材料的处理
• 2.14.2 精氨酸激酶折叠和去折叠的光谱学试验
• 2.14.3 参数A 和相图法对AK 光谱学的数据分析
• 2.15 精氨酸激酶表达调控模式研究
• 2.15.1 精氨酸激酶启动子的获得
• 2.15.2 精氨酸激酶表达调控模式研究
• 2.15.3 Northern 杂交分析
• 2.15.3.1 总RNA 的提取
• 2.15.3.2 甲醛变性胶电泳
• 2.15.3.3 转膜
• 2.15.3.4 预杂交
• 2.15.3.5 探针的制备
• 2.15.3.6 杂交
• 2.15.3.7 洗膜
• 2.15.3.8 放射自显影
• 3. 结果与分析
• 3.1 精氨酸激酶基因的克隆及表达分析
• 3.1.1 精氨酸激酶基因的克隆
• 3.1.2 精氨酸激酶基因的序列分析
• 3.1.3 精氨酸激酶原核表达、纯化及酶学性质研究
• 3.1.3.1 原核表达载体pET-AK 的构建
• 3.1.3.2 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 3.1.3.3 AK 的分离纯化结果
• 3.2 原核表达精氨酸激酶酶学性质研究
• 3.2.1 原核表达精氨酸激酶等电点及荧光发射光谱测定
• 3.2.2 原核表达精氨酸激酶的动力学特征
• 3.2.2.1 酶浓度对酶促反应速率的影响
• Arg和Km^ATP'>3.2.2.2 原核表达精氨酸激酶的Km^Arg和Km^ATP
• 3.2.2.3 原核表达精氨酸激酶的动力学参数
• 3.2.2.4 原核表达精氨酸激酶最适反应pH
• 3.2.2.5 原核表达精氨酸激酶最适反应温度
• 3.2.2.6 精氨酸激酶的包涵体复性
• 3.3 精氨酸激酶的定点突变、原核表达、纯化及酶学性质研究
• 3.3.1 精氨酸激酶的定点突变、原核表达和纯化
• 3.3.2 精氨酸激酶底物结合协同性有关的氨基酸位点的研究
• 3.3.2.1 突变酶的动力学
• 3.3.2.2 突变酶的内源荧光光谱学变化
• 3.3.2.3 突变酶的空间结构的模拟
• 3.3.2.4 突变酶的ANS 光谱
• 3.3.2.5 突变对精氨酸激酶的热稳定性和热聚沉的影响
• 3.3.2.6 突变对盐酸胍诱导的精氨酸激酶失活的影响
• 3.3.2.7 突变对精氨酸激酶的去折叠和再折叠的影响
• 3.3.2.8 突变酶的动力学和稳定性参数
• 3.3.2.9 271 位半胱氨酸突变对精氨酸激酶的影响
• 3.3.3 精氨酸激酶基因的表达调控分析
• 3.3.3.1 RT-PCR 和酶活性分析
• 3.3.3.2 精氨酸激酶表达模式分析
• 3.3.3.3 精氨酸激酶基因的启动子和上游元件分析
• 4 讨论
• 4.1 精氨酸激酶的基因序列分析
• 4.2 精氨酸激酶的原核表达和纯化
• 4.3 突变对底物结合协同性的影响及其作用机制
• 4.4 突变对酶空间结构、稳定性的影响及其作用机制
• 4.5 精氨酸激酶的表达调控研究
• 4.6 进一步研究方向
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的和待发表的论文