上皮性卵巢癌中FANCF基因表达缺陷及其启动子CpG岛过甲基化研究

论文摘要

第一部分上皮性卵巢癌中FANCF基因表达缺陷与其启动子区甲基化的关系目的研究上皮性卵巢癌中FANCF（Fanconi anemia complementation group F）基因表达变化，分析这种差异表达与该基因启动子区CpG （Cytosine phosphate guanosine）岛甲基化的关系。方法逆转录聚合酶链技术（Reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）检测7种卵巢癌细胞系、18例卵巢癌组织和10例正常卵巢组织中FANCF基因的表达；Western Blot对FANCF蛋白进行定量检测，分析蛋白水平上的FANCF表达的变化，并与正常卵巢组织中的FANCF基因表达情况进行对比。同时用甲基化特异性的PCR技术（Methylation specific PCR，MSP）对细胞系和组织中的FANCF基因DNA进行甲基化分析。结果大部分卵巢癌细胞系和组织中FANCF mRNA和蛋白的表达均显著下降，其中细胞系、卵巢癌组织和正常卵巢组织中FANCF mRNA表达分别为0.15±0.10、0.33±0.08、1.61±0.13，卵巢癌细胞系、卵巢癌组织分别与正常卵巢组织相比，统计学分析差异均有显著性（P＜0.01）。蛋白分析结果与mRNA结果相同。卵巢癌组织中41.7％（5／12）的FANCF基因表达下降的原因是FANCF基因启动子区域CpG岛甲基化。卵巢癌细胞系和组织中甲基化率分别为14.3％（1／7）和27.8％（5／18）。所有甲基化的细胞系和卵巢癌组织的FANCF表达均下降。甲基化更易于出现于年轻的患者[40％（4／10），＜=48岁；12.5％（1／8），＞48岁]。FANCF基因甲基化多出现于晚期卵巢癌患者，甲基化者均为Ⅱc期以后的患者（2个Ⅱc期，3个Ⅲ期）。结论FANCF基因表达缺陷在卵巢癌发生发展有重要的作用，甲基化可能是其表达缺陷的一种重要机制并与其预后关系密切，但甲基化并不是FANCF表达缺陷的唯一原因。第二部分甲基转移酶抑制剂对卵巢癌细胞中FANCF基因表达影响及其与紫杉醇相互作用的研究目的探讨甲基转移酶抑制剂5-杂氮-2′-脱氧胞苷（5-Aza-2′-deoxycytidine，5-ADC）对FANCF甲基化的卵巢癌细胞系OVCAR3中FANCF基因表达的影响，观察5-杂氮-2′-脱氧胞苷对人卵巢癌细胞的FANCF基因表达的调节、对卵巢癌细胞增殖的影响及其对化疗药物紫杉醇敏感性的影响，探讨其抗肿瘤效应及可能的机理，寻找卵巢癌治疗的新靶点。方法采用甲基转移酶抑制剂5-杂氮-2′-脱氧胞苷处理FANCF基因甲基化的卵巢癌细胞系OVCAR3后，用甲基化特异性PCR（MSP）分析FANCF基因甲基化状态，逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测FANCF mRNA的表达，FANCF蛋白表达采用Western Blot检测，4-甲基偶氮唑蓝[3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT]染色分析细胞生长曲线，流式细胞仪检测细胞处理前后对紫杉醇的敏感性差异。建立人卵巢癌OVCAR3细胞系裸鼠荷瘤模型，观察5-杂氮-2′-脱氧胞苷处理前后的肿瘤的生长情况。用免疫组织化学技术检测裸鼠荷瘤中FANCF蛋白表达的变化。以FANCF非甲基化卵巢癌细胞系A2780裸鼠荷瘤模型作为对照。结果5-杂氮-2′-脱氧胞苷处理可以使卵巢癌细胞系OVCAR3中FANCF基因甲基化消失，基因表达增高。处理前后其mRNA表达分别为0.05±0.01与0.76±0.05。同时发现细胞增殖缓慢，细胞倍增时间延长了24h。体内试验也验证了肿瘤去甲基化后细胞增殖延缓的结果，用药组和对照组肿瘤体积分别为（0.24±0.02）cm3和（0.68±0.01）cm3，最终肿瘤重量分别为（0.0351±0.0037）g和（0.2762±0.0217）g，差异有极显著性（P＜0.01），肿瘤组织免疫组化分析发现细胞用药组中FANCF蛋白表达增高。用药后细胞对化疗药物的敏感性下降，紫杉醇作用下凋亡率下降为（8.67±0.31）％，与对照组（23.25±1.44）％相比，差异有显著性（P＜0.05）。FANCF基因未甲基化的A2780细胞系在5-杂氮-2′-脱氧胞苷处理后仍然为非甲基化状态，基因表达也无明显改变，处理前后其mRNA表达分别为1.42±0.06与1.44±0.07，处理前后的裸鼠荷瘤模型中肿瘤体积和重量无差别表达，对化疗药物紫杉醇的敏感性无改变。结论甲基转移酶抑制剂5-杂氮-2′-脱氧胞苷体内体外均能使OVCAR3细胞中因甲基化而失活的FANCF基因重新表达，抑制肿瘤细胞生长，为治疗卵巢癌提供了实验依据。但其增加了紫杉醇化疗耐药的风险，两者可能不宜合用。

论文目录

• 中英文缩略词表
• 实验流程图
• 中文摘要
• Abstract
• 正文
• 前言
• 第一部分 上皮性卵巢癌中FANCF基因表达缺陷与其启动子区甲基化的关系
• 第二部分 甲基转移酶抑制剂对卵巢癌细胞中FANCF基因表达影响及其对紫杉醇细胞毒性影响的研究
• 第三部分 英文文章
• Promoter hypermethylation of FANCF plays an important role in the occurrence of ovarian cancer through disrupting Fanconi Anemia-BRCA pathway
• 第四部分 综述
• 卵巢癌紫杉醇耐药产生机理及逆转耐药策略
• 附录1 攻读学位期间发表论文目录
• 附录2 致谢