耐氟康唑白念珠菌ERG11基因突变筛查及鉴定芯片的研制

论文摘要

随着广谱抗生素、免疫抑制剂的广泛应用和介入疗法、器官移植等的深入开展,念珠菌感染呈现逐年上升的趋势,而抗真菌药物的广泛应用则加速了菌株的耐药进程。从分子水平研究念珠菌对抗真菌药尤其是唑类药物的耐药机制,解决念珠菌感染的快速诊断和有效治疗问题,是目前的热点。唑类药物的问世为治疗念珠菌感染拓展了全新的空间,但在其药物选择压力的作用下,念珠菌临床分离株中耐药株的比例明显增加。念珠菌耐药问题逐渐引起人们的重视,如何有效治疗耐菌株的感染正在渐渐成为一个新的医学难题,菌种鉴定和药敏试验结果成为影响临床治疗和判断预后的重要因素。白念珠菌是念珠菌感染的首要致病菌。从基因水平研究白念珠菌对唑类药物的耐药机制,国外的报道主要集中于欧美国家,国内研究则较少。目前认为,白念珠菌对唑类药物耐药存在多种机制,主要包括:（1）药物靶酶基因ERG11突变或过度表达。（2）编码多药流出通道的基因（CDR1、CDR2、MDR1、FLU1）过度表达。（3）生物被膜的形成。（4）细胞内液泡封闭药物分子。ERG11是羊毛甾醇14α-去甲基化酶的编码基因,14α-去甲基化酶是念珠菌细胞膜麦角固醇合成途径中的关键酶,对维持细胞膜的正常结构和功能具有重要意义。唑类抗真菌药物分子可与14α-去甲基化酶分子结合,阻断羊毛固醇去甲基化过程,影响麦角固醇合成。ERG11的突变可以改变14α-去甲基化酶的氨基酸序列,当这种改变足以影响酶分子的空间构型时,酶分子与药物分子间的亲和力可能被削弱,导致菌株耐药。理论上,菌株ERG11基因的过度表达可以使14α-去甲基化酶表达增加,在有限浓度的药物作用下,仍然维持良好的麦角固醇生物合成通路,也可以造成菌株耐药。但现在多认为菌株耐药性的形成与ERG11的过度表达无关,ERG11基因的突变才是这一耐药机制的主要方面。迄今报道的ERG11基因错义已逾70种,可以引起14α-去甲基化酶在61个氨基酸残基上发生69种改变。其中,已经实验证实可以导致菌株对氟康唑耐药的氨基酸置换仅有6种,即Y132H、T315A、S405F、G464S、R467K和1471T。在单株耐药菌株中,可以是多种耐药机制并存,共同参与菌株耐药性的形成;也可以是仅有一种机制起作用,例如,单纯ERG11基因T541C点突变即可导致菌株耐药。如果能够利用分子生物学手段检测到可以直接导致菌株耐药的基因突变,即可以在不必进行药敏试验的情况下确定菌株的耐药表型。基因芯片技术的出现和成熟,为这一设想提供了技术平台。基因芯片又被称为DNA芯片（DNA chip）、DNA阵列（DNA array）、DNA微阵列（DNA microarray）等,该技术是近年出现的分子生物学与微电子技术相结合的核酸检测分析技术,采用原位合成或显微点样技术将大量DNA探针有序地固化于支持物表面,然后与带有标记的核酸样品杂交,通过对杂交信号的检测分析,获得样品的基因序列、基因表达等遗传信息。该技术具有高度并行性、多样性、微型化和快速自动化等特点,成为后基因组时代最重要的基因功能分析技术之一。基因芯片技术已经渗透到生物科学领域的许多方面,有人将其应用于念珠菌全基因组多种基因的检测,并用于比较氟康唑敏感株和耐药株间的差别,也有人将其用于包括念珠菌在内的真菌菌种鉴定,认为DNA芯片在菌种鉴定方面具有极高的敏感性和特异性。但在用DNA芯片检测白念珠菌耐药菌株方面,国内外均未见相关文献报道。目的了解念珠菌临床分离株的菌种分布情况和对氟康唑的敏感性。筛查白念珠菌ERG11基因的错义突变,探讨突变与氟康唑耐药之间的关系。制备DNA芯片,鉴定常见的念珠菌种和可导致菌株对氟康唑耐药的ERG11突变,对DNA芯片技术应用于念珠菌菌种鉴定和药敏鉴定进行初步探索。方法收集临床标本,培养并分离念珠菌株,转种于改良SDA斜面上4℃保存。利用CHROMagar显色培养基作为初筛手段,鉴定白念珠菌（含都柏林念珠菌）、热带念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌;辅以血清芽管生成试验、蔗糖同化试验、玉米土温80厚壁孢子形成试验来进一步确认白念珠菌和都柏林念珠菌;辅以四氮唑红（TZC）还原试验来进一步确认热带念珠菌;近平滑念珠菌及其它念珠菌以VITEK2自动鉴定系统鉴定;PCR扩增白念珠菌（含都柏林念珠菌）25S rDNA转座内含子保守序列,区分白念珠菌和含都柏林念珠菌并进行白念珠菌种内分型。联合应用微量稀释法和纸片扩散法,体外测定氟康唑对试验菌株的MIC,确定敏感株（S）、剂量依赖敏感株（S-DD）和耐药株（R）。微量稀释法按照美国临床试验标准协会（CLSI）制定的M27-A2方案实施,判读结果时,需对照纸片扩散法的结果,如结果相抵触,则重复试验再判读,最终以微量稀释法结果为准。参考白念珠菌ERG11标准序列（GeneBank X13296）设计3对引物,用Pfu高保真DNA多聚酶分段扩增全部白念珠菌临床耐药株、2株标准耐药株、4株标准敏感株、部分临床敏感株的ERG11基因,以其中ERG11序列已明确的2株标准耐药株作为质控。用凝胶回收试剂盒进行PCR产物纯化,将纯化的PCR产物进行测序,检测突变。根据白念珠菌ERG11基因T541C、A1090G、C1361T、G1537A、G1547A、T1559C等6种突变序列,每种突变设计至少2条等位基因特异性探针（PM）和1条错配探针（MM）;根据白念珠菌、都柏林念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌和热带念珠菌等6种真菌的内转录间隔区ITS2保守序列,分别设计1条种特异性探针。用OmniGridTM100点样仪制备DNA芯片,每个探针重复三次,形成三个阵列。用双重PCR方法扩增经ERG11测序的白念珠菌和热带念珠菌C2a、光滑念珠菌Y10a、都柏林念珠菌C8a、克柔念珠菌ATCC6258、近平滑念珠菌ATCC22019等5株标准株的ERG11和ITS2种特异性序列。用醋酸钠/乙醇法纯化双重PCR产物,用DNaseⅠ进行酶切片段化,使酶切产物的片段长度在100 bp左右。针对T541C、A1090G、C1361T、G1537A、G1547A、T1559C等6种ERG11突变序列和白念珠菌、都柏林念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌和热带念珠菌等6种常见条件致病性念珠菌的内转录间隔区（IST2）种特异性序列,人工合成12条50 bp互补寡核苷酸链。用脱氧核苷酸末端转移酶（TDT）对片段化的双重PCR产物和50 bp寡核苷酸链进行Cy3荧光素标记后,进行芯片杂交。杂交后的芯片用GenePix 4000B共聚焦激光扫描仪进行扫描,利用GenePix Pro提取每条探针的荧光信号强度值,做出菌种鉴定和突变检测。结果共收集临床念珠菌426株,其中263株分离自VVC病人的阴道分泌物标本,101株分离自痰液标本,22株分离自尿液标本,16株分离自皮屑或甲屑标本,7株分离自菌血症病人的血液标本,6株分离自口腔刮片标本,其余11株来自其它部位。分离白念珠菌293株（68.8%）,热带念珠菌52株（12.2%）,光滑念珠菌46株（10.8%）,近平滑念珠菌14株（3.3%）,克柔念珠菌10株（2.3%）,都柏林念珠菌5株（1.2%）,其它念珠菌6株（1.4%）。念珠菌临床株对氟康唑的敏感率为84.5%（360/426）,剂量依赖敏感率为7.0%（30/426）,耐药率为8.5%（36/426）。白念珠菌对氟康唑的敏感率89.4%（262/293）,剂量依赖敏感率为5.5%（16/293）,耐药率为5.1%（15/293）;热带念珠菌对氟康唑的敏感率92.3%（48/52）,剂量依赖敏感率为5.8%（3/52）,耐药率为1.9%（1/52）;光滑念珠菌对氟康唑的敏感率56.5%（26/46）,剂量依赖敏感率为23.9%（11/46）,耐药率为19.6%（9/46）。15株白念珠菌耐药株均为A型。共有29株白念珠菌ERG11基因进行了PCR扩增和测序,包括上述15株临床耐药株、8株临床敏感株和6株标准株。共发现37种突变,其中19种为错义突变,另外18种属于同义突变。在耐药株中发现8种错义突变,在敏感株中发现13种错义突变。标准耐药株的ERG11测序结果与已知序列相同。在14株耐药株ERG11中,均同时检测到G487T和T916C,且不伴有其它任何突变。在另1株耐药株GZ04中,检测到4种错义突变T495A、A530C、T541C、T1493A,在标准敏感株中检测到T495A、A504C、G820T、A945C等纯合突变和T495A/C、T566G/T、G630T/G、G635C/G、C1271A/C、G1289T/G等杂合突变。在临床敏感株C261、0461、2855.中未检测到错义突变。在另外5株临床敏感株C522、C1307、0920、2827、2928中检测到纯合突变T495A、A530C、G640A、G820C、A945C和杂合突变A945C/A、G1609A/G。进行芯片杂交的菌株共34株。芯片杂交正确鉴定出上述34株试验菌株的菌种和其中29株白念珠菌ERG11基因中可致唑类耐药的已知突变,正确鉴定了12条人工合成的50 bp ERG11突变序列和ITS2种特异性序列。敏感性和特异性均为100%。结论（1）白念珠菌仍是最主要的致病性念珠菌,白念珠菌的分离比例和念珠菌对氟康唑的敏感性均与既往报道相仿。（2）ERG11突变G487T（A114S）、T916C（Y257H）可能参与菌株对氟康唑耐药。A504C（K119N）、G820T（D225Y）、G820C（D225H）、G640A（E165K）等突变不能导致菌株对氟康唑耐药。（3）用DNA芯片进行念珠菌菌种鉴定和白念珠菌ERG11已知突变筛查,结果可靠。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 第一部分:念珠菌的鉴定与白念珠菌ERG11基因测序分析
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第二部分:DNA芯片在念珠菌鉴定和ERG11氟康唑耐药突变筛查中的应用
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附表
• 附图
• 参考文献
• 综述一 都柏林念珠菌与白念珠菌鉴别研究进展
• 综述二 耐唑类药白念珠菌ERG11基因点突变
• 致谢
• 攻读博士学位期间发表的论文
• 学位论文评阅及答辩情况表
• 英文论文一
• 英文论文二