Ghrelin及其受体GHSR在前列腺癌中的分子影像学研究

论文摘要

前列腺癌是男性生殖系统常见的恶性肿瘤,前列腺特异性抗原（PSA）筛查的广泛应用,以及前列腺癌治疗方式的不断进步,使前列腺癌患者可以在更低的PSA水平上和更早的阶段得以诊断和治疗。广泛开展的前列腺癌的筛查和早期诊断,能够降低前列腺癌的特异性死亡率,并减少晚期前列腺癌并发症的发生率。但是在通过早期诊断对前列腺癌进行有效控制的同时,如何减少对前列腺癌的过度治疗,仍然是目前前列腺癌临床决策中需要面对的一个问题。近年大量的研究被投入到前列腺癌的精确诊断领域,其中无创性分子影像学技术能够对侵袭性肿瘤和缓慢进展性肿瘤进行更有效的鉴别,从而协助临床决策者在前列腺癌的早期诊断与过度治疗之间取得平衡。目前,越来越多的研究者开始关注针对前列腺肿瘤特异性受体的造影剂及其在前列腺癌影像学中的应用,该类造影剂能够在提供物理影像信息的同时,提供肿瘤的生物学信息,从而对前列腺肿瘤形态进行更好的评估,并为前列腺肿瘤的定向治疗（focal therapy）提供指导信息。Ghrelin为具有28个氨基酸残基的多肽,通过结合其特异性受体GHSR产生作用。GHSR属于G蛋白偶联受体家族,参与生长激素分泌的调控。GHSR表达于正常成人的脑组织、垂体组织以及其他外周组织。GHSR同时表达于多种人类肿瘤组织,并且GHSR在正常人类组织和不同肿瘤组织内的表达水平存在明显差异,提示将GHSR作为肿瘤特异性靶向受体而应用于肿瘤的诊断和治疗的可能性。本研究在mRNA水平上和蛋白水平上对Ghrelin及其受体GHSR在人类前列腺癌细胞及组织中的表达进行了研究；通过生物化学的方法对Ghrelin类似物进行了人工合成及荧光素标记；将合成的Ghrelin类似物应用于前列腺癌细胞系和人类前列腺癌组织的活体外标记研究,对将Ghrelin类似物及其靶向受体GHSR应用于前列腺肿瘤鉴别诊断的可行性进行评价；同时使用禽胚胎构建活体内前列腺癌细胞的绒毛尿囊膜（CAM）模型,进一步评价Ghrelin类似物对活体内前列腺癌细胞的生长影响。通过上述实验,本研究证实Ghrelin及GHSR在前列腺癌细胞系和人类前列腺组中具有一定水平的mRNA表达及蛋白表达,并且在激素非依赖性前列腺癌细胞和人类前列腺组织中,GHSR lb具有高于正常水平的表达。Ghrelin类似物可以通过标准的多肽固相合成法进行合成,并进行半抗原FITC标记,同时截短设计的18-19肽Ghrelin类似物易于合成并其能够维持其有效结合性。Ghrelin类似物FITC-Ghrelin （1-19）及Ghrelin （1-18）能够有效标记前列腺癌细胞和组织,并且这种结合是依赖于GHSR的特异性结合。在前列腺癌活细胞中,Ghelin类似物探针与GHSR结合之后,能够进一步通过GHSR所介导的内化作用进入细胞内部,在细胞内发生聚集,有助于提高活体成像的信号／背景比值。通过对活体外人类前列腺组织中的标记信号进行定量分析,Ghrelin类似物探针能够在癌性／癌前性前列腺组织和良性前列腺组织之间进行有效区分。本研究使用包含绿色荧光蛋白GFP序列的质粒对PC-3细胞进行转染,获得稳定表达GFP的PC-3细胞（PC-3-GFP）,并且PC-3-GFP细胞被种植于禽胚胎CAM内后,能够继续稳定生长,形成可于荧光显微镜下进行实时观察的肿瘤模型。本研究在活体模型内对Ghrelin类似物作用于肿瘤生长的干预效应进行了探索性研究,观察到Ghrelin类似物在活体模型内能够产生对PC-3细胞生长的抑制效应。基于上述研究结果,本研究认为Ghrelin类似物在人类前列腺肿瘤的无创性分子影像学诊断中的应用具有可行性。不同病理改变的前列腺组织中GHSR具有不同类型和程度的表达。Ghrelin分子探针能够通过靶向作用,与位于前列腺细胞上GHSR受体发生特异性结合,并在结合后进一步通过内化作用聚集于细胞内,从而在影像结果上显示出不同病理改变区域的不同信号强度,为前列腺肿瘤的鉴别提供诊断信息。Ghrelin类似物在活体模型内表现出对前列腺癌细胞生长的抑制倾向,提示Ghrelin类似物在前列腺癌的活体内应用不会对肿瘤控制产生负面影响。在活体内Ghrlein对前列腺肿瘤诊断的有效性和安全性尚需进一步的研究证明。本研究为加拿大西安大略大学Lawson医学中心研究项目,研究编号16840E。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 Ghrelin及其受体GHSR在前列腺癌中的表达
• 1. 材料和方法
• 1.1 前列腺癌细胞系及人类前列腺癌组织
• 1.2 半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）
• 1.2.1 细胞及组织RNA样本提取
• 1.2.2 第一链cDNA合成（20μl反应体系）
• 1.2.3 cDNA序列扩增（50μl反应体系）
• 1.2.4 琼脂糖凝胶电泳
• 1.3 蛋白免疫印迹（Western blot）
• 1.3.1 细胞及组织蛋白质样本提取
• 1.3.2 SDS聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳
• 1.3.3 转膜
• 1.3.4 Ghrelin受体GHSR的免疫检测
• 1.3.5 ECL化学发光,显影和定影
• 1.3.6 膜再生
• 1.3.7 β-Actin免疫检测
• 1.3.8 ECL化学发光,显影和定影
• 1.4 统计学分析
• 2. 结果
• 2.1 前列腺癌中Ghrelin及GHSR的mRNA表达
• 2.2 前列腺癌中GHSR的蛋白表达
• 3. 讨论
• 4. 结论
• 第二章 Ghrelin类似物的合成及半抗原FITC的标记
• 1. 材料和方法
• 1.1 Ghrelin类似物的设计
• 1.2 试剂与设备
• 1.3 多肽链的组装
• 1.4 多肽链的侧链修饰及树脂裂解
• 1.5 半抗原FITC（异硫氰酸荧光素）标记多肽链
• 1.5.1 多肽的准备
• 1.5.2 FITC的准备
• 1.5.3 结合
• 1.5.4 透析
• 1.5.5 凝胶柱层析
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 4. 结论
• 第三章 Ghrelin类似物探针对前列腺肿瘤GHSR的识别
• 1. 材料和方法
• 1.1 前列腺癌细胞系PC-3的细胞爬片
• 1.2 人类前列腺癌组织的冰冻切片
• 1.3 Ghrelin类似物探针对PC-3细胞及人类前列腺组织GHSR的标记
• 1.4 FITC-Ghrelin（1-19）结合GHSR的竞争性抑制实验
• 1.5 FITC-Ghrelin（1-19）结合GHSR的内化（Internalization）抑制实验
• 1.6 FITC-Ghrelin（1-19）探针信号的定量分析
• 1.7 统计学分析
• 2. 结果
• 2.1 Ghrelin类似物探针对PC-3细胞的标记为GHSR依赖的特异性结合
• 2.2 Ghrelin类似物探针结合GHSR后通过内化作用进入PC-3细胞内
• 2.3 Ghrelin类似物探针能够对不同病理改变的前列腺组织进行区分
• 3. 讨论
• 4. 结论
• 第四章 活体模型内Ghrelin类似物对前列腺癌生长的影响
• 1. 材料和方法
• 1.1 表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的前列腺癌细胞PC-3-GFP的建立
• 1.2 活体模型内Ghrelin类似物对前列腺癌PC-3-GFP细胞生长的干预
• 1.3 活体模型内前列腺癌PC-3-GFP细胞生长情况的观察及肿瘤组织采集
• 1.4 人类alu实时定量PCR分析
• 1.4.1 肿瘤组织DNA样本提取
• 1.4.2 人类alu DNA序列扩增
• 1.5 人类alu常规PCR分析
• 1.6 统计学分析
• 2. 结果
• 2.1 表达绿色荧光蛋白的前列腺癌PC-3-GFP细胞
• 2.2 前列腺癌PC-3-GFP细胞在禽胚胎CAM内的生长
• 2.3 Ghrelin（1-18）对前列腺癌PC-3-GFP细胞在CAM模型内的生长影响
• 3. 讨论
• 4. 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况