山羊早期胚胎发育基因表达与调控的研究

论文摘要

胚胎发育一直是生命科学研究的主题之一。从一个单细胞发育成一个多细胞的个体,是许多基因和蛋白质在时间和空间上顺序表达的结果,核内基因的遗传信息控制着细胞质内蛋白质的合成,细胞质中的调控因子又反过来控制以后的发育时期中核内遗传信息的表达,胚胎内这种核与质之间的矛盾,相互作用和相互制约,推动着发育过程的进行。通过卵母细胞的体外成熟、体外受精、体外培养的方法和常规同期发情、超数排卵处理,获取山羊体外培养的成熟卵母细胞、2细胞、4细胞和8～16细胞胚胎、桑椹胚和囊胚及体内发育的2细胞、4细胞和8～16细胞胚胎、桑椹胚和囊胚。运用mRNA差异显示技术和蛋白质相关技术,分析胚胎发育不同阶段基因表达和蛋白质组的变化,从分子水平了解山羊胚胎发育过程中基因和蛋白质整体变化规律,探讨不同发育阶段基因表达的模式和胚胎发育机理,以期为哺乳动物胚胎早期发育基因表达的分子调控机制研究提供参考。mRNA差异显示共筛选到了44条分别在不同时期胚胎特异表达的片段,其中成熟卵母细胞4条,2细胞期7条（体内5条,体外2条）,4细胞期8条带（体内5条,体外3条）,8～16细胞期14条带（体内11条,体外3条）,桑椹胚和囊胚9条带（体内8条,体外1条）,全程表达2条（体内1条,体外1条）,经过测序及比对分析,表明有10条带与已知的功能基因或调控基因相似,其余条带为未知功能基因或无相似基因。其中:S12在卵母细胞中特异性表达与蛋白激酶基因具有较高的同源性（98%）,蛋白激酶对卵母细胞成熟过程中基因转录、调控和表达调控起到重要作用;Y62序列在2细胞胚胎中特异性表达与磷酸酶基因具有较高的同源性（98%）,磷酸酶通过信号传递,对细胞的分裂活动具有重要的调控作用;E66序列在2细胞胚胎中特异性表达与动力球蛋白基因具有较高的同源性（95%）,动力球蛋白为胚胎发育提供能量,从而对早期胚胎发育过程中的基因转录调控和表达调控起到重要作用;Y72序列4细胞胚胎中特异性表达与表皮生长因子受体基因具有较高的同源性（89%）,EGF通过刺激胚胎细胞分裂增殖,而影响早期胚胎的生长发育;Sg78序列在4细胞和8-16细胞胚胎中特异性表达与牛醛氧化酶（脱氢酶）基因具有较高的同源性97%,E8序列在8-16细胞胚胎中特异性表达与氨基乙酸脱氢酶基因具有较高的同源性（97%）,氧化酶（脱氢酶）通过调控ATP的合成,提供细胞活跃代谢以及DNA去甲基化和核内基因组再程序化时的能量需要;S81序列在8-16细胞胚胎中特异性表达与连接蛋白基因具有较高的同源性（97%）,连接蛋白促进卵裂球间缝隙连接,促进胚胎的致密化和囊胚的形成;S97序列在桑椹胚和囊胚中特异性表达与老鼠白血病抑制因子（LIF）受体基因具有较高的同源性（95%）,LIF是调节胚胎发育、启动胚胎着床过程的重要细胞因子,在妊娠识别过程中起到了重要作用;Y97序列在桑椹胚和囊胚中特异性表达与生长激素（GH）基因具有较高的同源性（91%）,GH是调节调节母体的妊娠生理,影响生殖激素的分泌,从而推动胚胎生长、分化;Sg6789为早期胚胎发育各时期均表达的基因,其序列与肥胖基因（ob）转录翻译的Leptind蛋白具有较高的同源性（96%）,Leptin作用于卵母细胞的成熟以及早期胚胎的分裂,参与早期胚胎的生长发育过程。体内外胚胎蛋白经蛋白质电泳和染色,能够检测到的蛋白斑点数为195个,其中卵母细胞14个蛋白质斑点;2细胞胚胎检测到32个蛋白质斑点,其中体内16个,体外16个,匹配的蛋白斑点为15个,匹配率为93.8%;4细胞胚胎检测到39个蛋白质斑点,其中体内21个,体外18个,能匹配的蛋白斑点为16个,匹配率为76.9%;816细胞期检测到53个蛋白质斑点,其中体内29个,体外24个,能匹配的蛋白斑点为19个,匹配率为71. 7%;桑椹胚和囊胚时期57个蛋白质斑点,其中体内30个,体外27个,能匹配的蛋白斑点为20个,匹配率为70. 2%。在体内发育的胚胎蛋白质电泳图谱中有11个蛋白斑点在体外培养的胚胎蛋白质电泳图谱中不存在,推测这些蛋白与胚胎的发育阻滞有关。在山羊胚胎早期发育过程中始终能够检测到的位点有4个,卵母细胞的蛋白斑点在2细胞胚胎中全部能够找到,这些蛋白质在胚胎发育进程中起重要作用。体内外不同时期差异蛋白和差异基因表达显示:山羊受精卵在卵裂后就开始合成胚胎自身的mRNA和蛋白质;不同阶段基因表达和胚胎蛋白质的组成存在着差异,说明胚胎基因的表达是依照一定的时空性的,前一阶段基因的不表达,影响下一阶段基因的表达,从而影响胚胎蛋白的合成,影响胚胎解除阻滞进入生长发育阶段;呈阶段性表达的基因及其翻译的蛋白,在随后邻近的胚胎发育阶段中消失,显示这些基因和蛋白可能与相应胚胎的形体特征发育有关,或进一步影响邻近胚胎的形体特征发育;全程表达的基因和蛋白,参与胚胎植入前发育的全过程,说明这些基因可能是生命活动所必需的。本实验在分子水平上对特异性表达的基因和蛋白进行分析,从蛋白质的变化初步了解了山羊胚胎结构基因激活表达的实施,但对于各特异性表达的基因在染色体上的精确定位、结构以及特异蛋白斑点的功能等方面,尚需通过大量分析和实验进行进一步研究。

论文目录

• 缩略词表
• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 文件综述
• 1 动物早期胚胎发育的基因表达
• 1.1 卵母细胞成熟过程中母源性基因的表达及其产物的贮存
• 1.2 胚胎基因组的激活
• 1.3 早期胚胎发育的形成与调控因子
• 2. MRNA 差异显示技术的原理与方法
• 2.1 mRNA 差异显示技术的原理与优点
• 2.2 mRNA 差异显示技术的不足
• 2.3 mRNA 差异显示技术的改进和发展
• 2.4 动物功能基因的研究
• 2.5 mRNA 差异显示技术在动物早期胚胎发育研究中的应用
• 3. 蛋白质组在胚胎早期发育上的研究与应用
• 3.1 蛋白质组的概念
• 3.2 蛋白质组和基因组的关系
• 3.3 基因组研究的不足
• 3.4 蛋白质组学研究的意义
• 3.5 差异蛋白质组学的提出与研究
• 3.6 利用差异蛋白质组学技术研究胚胎发育相关的特异蛋白
• 4. SDS-PAGE 在蛋白质分离与鉴定上的应用
• 4.1 聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳原理与优点
• 4.2 丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的应用
• 5. 本研究的目的和意义
• 第二章 山羊早期胚胎基因差异表达的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 主要仪器及设备
• 1.2 实验材料
• 1.2.1 山羊早期胚胎
• 1.2.2 引物
• 1.3 主要试剂与溶液配制
• 1.3.1 主要试剂
• 1.3.2 常规溶液的配制
• 1.3.3 卵母细胞体外成熟与胚胎体外培养试剂
• 1.3.4 差异片段的连接、转化与克隆的主要试剂
• 1.3.5 质粒DNA 的提取、鉴定的主要试剂
• 1.4 实验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 差异显示PCR 的结果
• 2.2 二次PCR 产物的克隆转化与鉴定
• 2.3 体内外胚胎差异条带分析
• 2.4 相似功能的基因片段克隆序列比对结果分析
• 3. 讨论
• 3.1 母源特异性基因的表达
• 3.2 合子形成时特异性基因的表达
• 3.3 4 细胞期基因的特异性表达
• 3.4 8～16 细胞期特异性基因的表达
• 3.5 桑椹胚和囊胚期特异性基因的表达
• 3.6 早期胚胎全程表达的基因
• 4. 结论
• 第三章 山羊体内外胚胎发育不同时期蛋白质差异表达和调控分析
• 1. 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 主要实验仪器
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要溶液的配制
• 1.5 山羊胚胎蛋白质样品制备
• 1.6 胚胎蛋白质电泳
• 1.7 染色
• 1.8 凝胶照相
• 2. 结果与分析
• 2.1 山羊早期胚胎蛋白质组成分析
• 2.2 体内外蛋白质差异分析
• 2.3 蛋白质在早期胚胎发育过程中的变化
• 3 讨论
• 3.1 蛋白质提取及分离方法对结果的影响
• 3.2 体内外胚胎蛋白与基因表达的差异
• 3.3 胚胎基因及其蛋白在胚胎发育过程中表达与调控
• 3.4 mRNA 及其翻译表达的蛋白质
• 4 结论
• 参考文献
• 附录：差异表达片段的测序结果
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文