白藜芦醇三甲醚（BTM）乳胶的构建及局部施予兔踝关节的药动学评价

论文摘要

一、目的白藜芦醇三甲醚（3,5,4’-trimethoxy-trans-stilbene, BTM）是白藜芦醇（Resveratrol, Res）的天然三甲基化衍生物,与Res同具有抗炎效应,能阻止骨关节炎（Osteoarthritis, OA）的发生和发展,可能成为一种新的OA治疗药物。考虑到OA是一种以关节局部软骨退行性病变的器官性疾病,局部施药可提高局部组织药物浓度而能提高疗效,且安全性更好；而BTM的亲脂性强于Res,透过经皮给药主要屏障-角质层的能力增强,为其局部应用提供了可能。本课题拟在对BTM基本理化性质研究的基础上构建其外用乳剂型凝胶,并通过体外经皮渗透实验和局部药动学研究评价其局部施用治疗OA的可行性,为BTM新型经皮给药系统提供实验基础。二、方法与结果1.BTM基本理化性质BTM为浅黄色或类白色结晶性粉末,熔点在56℃～57℃,在水中几乎不溶,在甲醇、乙醇中略溶,在乙腈、乙酸乙酯、三氯甲烷、丙酮中易溶；在10%～40%乙醇生理盐水和10%～40%PEG-400生理盐水中溶解度呈梯度递增。BTM具有强亲脂性,LogP值为4.36±0.12。BTM对光不稳定,其二苯乙烯键易发生顺反异构,光源对其影响大小为日光（5300～31300 lx）>强光（4500 lx）>日光灯（231 lx）>红光（55 lx）。光强度越大,顺反异构转换速度越快,在日光下,45 min达到平衡,平衡时BTM量仅占光照前的9%。在红光照射9h及日光灯照射1～2h内BTM几乎不发生异构化,这两种光源可提供安全操作光环境适用于不同的实验。2.BTM乳胶的构建及经皮渗透研究以外观性状、粒径及其分布、稳定性为评价指标进行BTM乳胶的处方筛选；以提高经皮渗透量为目标,采用改良Franz扩散池和离体乳猪皮肤模型研究BTM乳胶的体外经皮渗透性能,最终确定BTM乳胶处方为：主药（BTM,2.0%）、中链甘油三酯（MCT,10.0%）、聚氧乙烯氢化蓖麻油（RH-40,4.0%）、香叶醇（2.0%）、甘油（8.0%）、水（25%）、0.5%卡波姆940（50%）。采用磁力搅拌法制备初乳,正交设计优化的制备工艺为：将油相（BTM、MCT、RH-40.香叶醇）于60℃热熔,维持温度不变,将水相（甘油、水,60℃水浴混匀）加入油相,磁力搅拌（800 rpm） 5 min,冷却后得初乳。将0.5%卡波姆940凝胶（调节pH值约为7.4）加入初乳中搅拌混匀即得BTM乳胶。该乳胶呈乳白色半固态、细腻均匀,粒径在250 nm～310nm之间,PDI在0.171～0.315之间,pH约为7.0,40℃恒温条件下避光保存30天稳定。不同载药量乳胶中BTM经皮累积渗透量大小为：4%≈2%>1%；促渗剂的作用大小为：香叶醇>IPM>油酸>氮酮>橙花叔醇>空白对照；与单用香叶醇相比,促渗剂联用（香叶醇+丙二醇、香叶醇+IPM）未能明显提高BTM的经皮累积渗透量（P>0.05）,而与异丙醇联用时经皮累积渗透量明显降低（P<0.05）。在筛选的范围内,载药量为2%、促渗剂为2%香叶醇时BTM乳胶经皮渗透最大,24 h的经皮累积渗透量为6.07±1.17μg/cm2,促渗倍数为3.31。3.BTM乳胶局部药动学研究36只家兔（1.5～2.0 kg）,随机分为两组,各组再随机分为6个时间组,分别经局部给予BTM乳胶（相当于BTM 5 mg/关节）或灌胃给予BTM混悬液（30mg/kg）后,于0.5、1、3、6、9、12 h在心脏采血后处死（每时间点3只）,解剖分别取其左、右踝关节组织,记录重量；血样离心后取上清液采用甲醇蛋白沉淀、关节组织样品采用甲醇超声提取后进行HPLC分析,测定样品中BTM浓度。结果家兔局部给药组的血药浓度均低于检测限（9.2 ng/mL）,灌胃组0.5 h血药浓度最高为334.6±42.8 ng/mL,9h为17.9±17.0 ng/mL,提示局部给药可减少系统药物暴露量,用药安全性更高；局部给药与灌胃给药后关节组织中的BTM浓度在0.5 h因受血药浓度影响灌胃组大于局部给药组（P<0.05）,在1、3h无显著性差异（P>0.05）,在6、9、12 h局部给药组大于灌胃组（P<0.05）,提示局部给药在作用部位的药物浓度维持时间更长,具有缓释作用。三、结论外用施予BTM乳胶能透过皮肤进入关节局部,与口服灌胃组相比,局部给药能在关节组织聚集更高浓度,并具有一定缓释作用,其释药特点适用于慢性疾病OA的长期治疗；局部给药组的血药浓度远低于口服灌胃组,可减少OA患者可能出现的药物相互作用,提高了药物治疗的安全性。本文为BTM的剂型选择提供了实验依据,并为OA治疗药物给药途径选择、经皮给药系统研究等提供了方法参考。有关局部给予BTM治疗OA的药效学及局部刺激等的研究尚需要进一步进行。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 英文缩写词表
• 前言
• 第一章 处方前研究
• 1 仪器与材料
• 1.1 仪器
• 1.2 试药与试剂
• 2 方法与结果
• 2.1 外观性状
• 2.2 熔点
• 2.3 紫外吸收光谱
• 2.4 BTM含量测定分析方法的建立
• 2.4.1 色谱条件
• 2.4.2 线性范围
• 2.4.3 精密度
• 2.4.4 回收率
• 2.4.5 稳定性
• 2.5 溶解度
• 2.5.1 在有机溶剂中的溶解度
• 2.5.2 在水、生理盐水中的溶解度
• 2.5.3 在乙醇生理盐水和PEG-400生理盐水中的溶解度
• 2.6 油水分配系数
• 2.7 BTM的光致顺反异构研究
• 2.7.1 溶液配制
• 2.7.2 BTM的光致顺反异构化
• 2.7.3 照射光源对BTM顺反异构的影响
• 3 讨论
• 3.1 理化性质与经皮渗透的关系
• 3.2 光致顺反异构
• 4 小结
• 第二章 BTM乳胶的构建及其体外经皮渗透研究
• 1 仪器与材料
• 1.1 仪器
• 1.2 试药与试剂
• 1.3 动物
• 2 方法与结果
• 2.1 BTM乳胶的构建
• 2.1.1 BTM乳胶的主要评价指标
• 2.1.2 处方筛选
• 2.1.3 制备工艺筛选
• 2.1.4 工艺流程图及BTM乳胶的制备
• 2.2 BTM乳胶体外经皮渗透研究
• 2.2.1 皮肤的选择
• 2.2.2 离体皮肤的制备
• 2.2.3 接收液的选择
• 2.2.4 实验方案
• 2.2.5 数据处理与统计
• 2.2.6 接收液中BTM浓度测定方法的建立
• 2.2.7 载药量对BTM经皮渗透的影响
• 2.2.8 促渗剂对BTM经皮渗透的影响
• 2.2.9 促渗剂的用量对BTM经皮渗透的影响
• 2.2.10 促渗剂联用对BTM经皮渗透的影响
• 2.3 BTM乳胶初步稳定性研究
• 2.3.1 BTM乳胶含量测定方法的建立
• 2.3.2 稳定性研究
• 3 讨论
• 3.1 影响粒径及PDI大小的因素
• 3.2 BTM经皮渗透性能
• 4 小结
• 第三章 BTM乳胶家兔局部药动学研究
• 1 仪器与材料
• 1.1 仪器
• 1.2 试药与试剂
• 1.3 动物
• 2 方法与结果
• 2.1 试药
• 2.2 家兔实验前关节预处理
• 2.3 实验方案
• 2.4 血浆中BTM浓度测定分析方法的建立
• 2.4.1 色谱条件
• 2.4.2 溶液的配制
• 2.4.3 血样处理
• 2.4.4 专属性
• 2.4.5 线性范围
• 2.4.6 检测限和定量限
• 2.4.7 方法回收率与精密度
• 2.4.8 绝对回收率
• 2.4.9 冻融稳定性
• 2.4.10 样品处理液24h室温稳定性
• 2.4.11 长期保存（-20℃）稳定性
• 2.5 关节组织样品中BTM浓度测定方法的建立
• 2.5.1 色谱条件
• 2.5.2 关节组织样品处理
• 2.5.3 专属性
• 2.5.4 线性范围
• 2.6 数据处理
• 2.7 血药浓度与药时曲线
• 2.8 关节样品中药物浓度与药时曲线
• 3 讨论
• 3.1 血浆样品的处理
• 3.2 血浆样品测定色谱采集时间
• 3.3 家兔口服灌胃剂量的确定
• 3.4 关节局部药动学研究
• 3.5 局部给药后BTM在家兔体内的处置情况
• 3.6 灌胃给药后BTM在家兔体内的处置情况
• 4 小结
• 全文结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 致谢
• 论文发表情况