根癌农杆菌介导的DREB1C基因转化苜蓿的研究

论文摘要

此研究以本实验室通过多年筛选得到的、具有再生能力的紫花苜蓿品种“保定苜蓿”为基因转化的受体材料,通过根癌农杆菌介导法,将从拟南芥中克隆获得的调控植物对逆境反应的DREB1C转录因子基因转化到“保定苜蓿”中,以期获得具有更好抗逆性状的苜蓿新品种。本研究,将实验室原有的苜蓿组织培养配方进行了改良,从而获得了苜蓿组织培养再生植株的有效方案,同时,将原有的用于转化苜蓿的表达载体进行了改造,以便对再生的转基因植株进行筛选。初步鉴定表明,目的基因DREB1C转录因子基因已经整合到了苜蓿基因组上。本研究的主要结果如下:建立了一套用于保定苜蓿组织培养的高效再生体系。对作为外置体的材料进行了选择,分别选用下胚轴和子叶作为外植体,通过对其愈伤组织的诱导率进行比较,得出了下胚轴比子叶作为外植体能获得更好的效果。在愈伤组织诱导阶段,外植体被放在UM培养基和改良的SH培养基上,培养30天后,比较两种培养基上的愈伤组织的诱导率,从而进行不同培养基对于诱导愈伤组织能力的比较。改良的SH培养基相对于UM培养基对于愈伤组织的诱导更有效。同时还得出,在愈伤组织诱导阶段,2,4-D起到了关键的作用,KT能辅助2,4-D发挥更好的作用。在胚状体诱导阶段,不同浓度的KT和水解酪蛋白被加入到培养基内,以比较它们在胚状体的起始和成熟过程中所起的作用。培养20天以后,在含有0.2 mg/L KT和2 g/L水解酪蛋白的UM培养基上,得到了最大的胚状体诱导率。水解酪蛋白的加入提高了胚状体的成熟率和质量。含有15 g/L蔗糖的1/2MS培养基对于生根是很有效的。为了便于转基因植株的分子检测,利用重叠延伸PCR（gene splicing by overlap extension PCR, SOE PCR）方法克隆来自于水母的绿色荧光蛋白基因（GFP）和来自于拟南芥的目的基因DREB1C转录因子,并对其进行改造从而获得了融合基因。通过酶切和连接反应,将融合基因构建到表达载体pCAMBIA1301上,获得了具有DERB1C和GFP基因的重组表达载体pDR1- GFP,酶切和测序结果表明,该融合基因与预期相符。本实验所用的DREB1C转录因子基因,是在35s启动子的调控下、从拟南芥中克隆的、植物调控其自身抵抗外界逆境的信号基因。用根癌农杆菌介导的遗传转化法,将其整合到苜蓿基因组上。苜蓿的外植体放于含有目的基因及潮霉素抗性基因的载体pCAMBIA1301的农杆菌菌株GV3101中侵染。共培养3天后,外植体被转移到愈伤组织诱导培养基上（改良的SH培养基）,培养基中含有2mg/L 2,4-D、0.2mg/L KT、30 mg/L潮霉素和300 mg/L头孢霉素。培养大约3周以后,潮霉素抗性的愈伤组织被转移到胚状体诱导培养基上（UM培养基）,培养基含有0.6 mg/L KT、30 mg/L潮霉素和300 mg/L头孢霉素。大约4周以后,胚状体和小的植株就会从这些愈伤组织的表面生长出来。最后,成熟的胚状体和幼嫩的植株被转移到1/2 MS培养基上,以完成生根。经过PCR和RT-PCR分析得出,DREB1C基因已经整合到了再生植株的基因组上。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 根癌农杆菌的研究历史
• 1.1.1 Ti 质粒的结构区及相关的功能
• 1.1.2 根癌农杆菌的生物学特性
• 1.1.3 利用根癌农杆菌转化的原理
• 1.1.4 根癌农杆菌的侵染能力
• 1.2 转基因植物中外源 DNA 的整合特性
• 1.2.1 整合位点
• 1.2.2 整合拷贝数
• 1.2.3 外源DNA 结构对整合的影响
• 1.2.4 转化后整合位点的DNA 结构变化
• 1.2.5 转化方法对整合外源基因结构的影响
• 1.3 转录因子
• 1.3.1 近年来克隆的胁迫诱导的基因
• 1.3.2 转录因子的结构与功能
• 1.3.3 转录因子的调控作用
• 1.4 DREB（dehydration responsive element binding）转录因子
• 1.4.1 DREB 基因在逆境胁迫中的作用
• 1.4.2 DREB 转录因子的结构
• 1.4.3 在逆境胁迫中DREB 对顺势作用元件的识别
• 1.4.4 DREB 完成的是不依靠ABA 的信号传导途径
• 1.4.5 DREB 转录因子对于逆境的调控反应
• 1.5 苜蓿研究进展
• 1.5.1 苜蓿生产的现状
• 1.5.2 苜蓿组织培养的研究进展
• 1.5.2.1 外植体的选择
• 1.5.2.2 生长激素的配比
• 1.6 目前存在问题及发展趋势
• 第二章 保定苜蓿高频再生体系的建立
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料
• 2.2.2 培养基
• 2.3 方法
• 2.3.1 无菌苗的培养
• 2.3.2 外植体的准备
• 2.3.3 培养条件
• 2.3.4 愈伤组织的诱导
• 2.3.5 胚状体的诱导与植株的再生
• 2.3.6 不同浓度的KT 对于胚状体的发生与成熟的影响
• 2.3.7 水解酪蛋白对于胚状体成熟的影响
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 不同培养基对于愈伤组织诱导的影响
• 2.4.2 外植体的选择
• 2.4.3 不同浓度的KT 对于胚状体诱导的起始和成熟的影响
• 3.3.4 水解酪蛋白对于胚状体成熟的影响
• 2.4.5 植株的再生
• 2.5 讨论
• 第三章 DREB1C—GFP 融合基因植物表达载体的构建
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 材料
• 3.2.2 方法
• 3.2.2.1 质粒提取
• 3.2.2.2 DREB1C 基因的获得
• 3.2.2.3 GFP 基因的获得
• 3.2.2.4 回收PCR 扩增产物
• 3.2.2.5 融合基因的获得
• 3.2.2.6 表达载体的构建
• 3.2.2.7 转化感受态细胞
• 3.2.2.8 阳性克隆的筛选
• 3.2.2.9 与T 载体的连接
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 融合基因的克隆
• 3.3.2 表达载体pDR1- GFP 的鉴定
• 3.4 讨论
• 第四章 根癌农杆菌介导的DREB1C 基因转化苜蓿
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 材料
• 4.2.1.1 植物材料
• 4.2.1.2 农杆菌菌株和质粒
• 4.2.1.3 主要试剂
• 4.2.1.4 农杆菌培养基
• 4.2.2 实验方法
• 4.2.2.1 农杆菌的保存
• 4.2.2.2 农杆菌质粒的提取及检测
• 4.2.2.3 潮霉素选择压的确定
• 4.2.2.4 头孢霉素对于苜蓿组织培养的影响
• 4.2.2.5 农杆菌最佳侵染时间的确定
• 4.2.2.6 最佳共培养时间的确定
• 4.2.2.7 保定苜蓿再生过程中各步培养基的组成
• 4.2.2.8 利用农杆菌侵染外植体的操作
• 4.2.2.9 再生植株的获得
• 4.2.2.10 植物基因组DNA 的提取
• 4.2.2.11 再生植株的PCR 检测
• 4.2.2.12 RT-PCR
• 4.2.2.12.1 试剂及材料的处理
• 4.2.2.12.2 RNA 提取
• 4.2.2.12.3 RNA 纯化
• 4.2.2.12.4 mRNA 的反转录
• 4.2.2.12.5 PCR 扩增反应
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 表达载体的鉴定
• 4.3.2 潮霉素选择压的确定
• 4.3.3 头孢霉素对于苜蓿组织培养的影响
• 4.3.4 农杆菌最佳侵染时间的确定
• 4.3.5 最佳共培养时间的确定
• 4.3.6 凝胶电泳检测提取的基因组DNA
• 4.3.7 再生植株的PCR 检测
• 4.3.8 再生植株总RNA 的提取和RT-PCR 检测
• 4.4 讨论
• 4.4.1 潮霉素（hyg）浓度的筛选
• 4.4.2 苜蓿转化体系的建立
• 第五章 全文结论
• 5.1 主要结论
• 5.2 后续研究工作展望
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历