论文摘要
目的:砷在自然界分布广泛,毒性较强,对生物体的影响也是多方面的,在生物进化的过程中,许多生物从细菌到哺乳动物都产生了对抗砷毒的生理机制。我们在前期研究中已从人抗砷细胞株中筛选出了5条可能参与抗砷作用的基因。本研究选取人抗砷细胞株中表达明显上调的3条ATP结合盒基因作为研究对象,利用RNA干扰技术,体外观察抗砷基因的沉默作用,然后通过细胞毒性实验分析目的基因阻断前后,抗砷细胞株抗砷性的改变,力求找到明确的抗砷基因。方法:化学合成siRNA,在siPORTTMNeoFXTM转染剂的介导下转染人脐静脉内皮细胞ECV-304细胞,用半定量RT-PCR,real time PCR和Western-blot方法检测目的基因mRNA和蛋白水平的改变,然后通过MTT实验分析小分子干扰RNA阻断目的基因后,抗砷细胞株抗砷性的改变.结果: （1）ABCA1体外合成的3条siRNA通过siPORTTMNeoFXTM转染剂转染人脐静脉内皮细胞ECV-304细胞后,均能不同程度地抑制目的基因的表达。转染后48h的real time PCR检测显示siRNA-1, siRNA-2和siRNA-3组的目的基因的表达抑制率分别为32.08%士0.746%、55.08%±0.075%、87.09%±0.031%,与阴性对照组比较均有显著性差异（p<0.05）。其中,siRNA-3的抑制作用最强。而阴性对照siRNA组与未转染抗砷细胞组比较,ABCA1 mRNA表达无明显减低（p>0.05）.Western-blot方法检测蛋白改变结果与PCR检测相互一致。噻唑兰法（MTT）进行48h NaAsO2毒性试验后,实验组细胞对急性砷染毒表现出耐受性降低,siRNA-3组在各浓度下生存率都明显低于同步对照组。实验组LC50为8.05μΜ,对照组LC50为11.09μΜ。（2）ABCE1体外合成的2条siRNA通过siPORTTMNeoFXTM转染剂转染人脐静脉内皮细胞ECV-304细胞后,均能不同程度地抑制目的基因的表达。转染后48h的real time PCR检测显示siRNA-1, siRNA-2的目的基因的表达抑制率分别为46.6%士0.339%、73.8%±0.545%,与阴性对照组比较均有显著性差异（p<0.05）。其中,siRNA-2的抑制作用较强。而阴性对照siRNA组与未转染抗砷细胞组比较,ABCE1 mRNA表达无明显减低（p>0.05）.Western-blot方法检测蛋白改变结果与PCR检测相互一致。噻唑兰法（MTT）进行48h NaAsO2毒性试验后,实验组细胞对急性砷染毒仍表现出较强的耐受性。（3）ABCF1体外合成的3条siRNA通过siPORTTMNeoFXTM转染剂转染人脐静脉内皮细胞ECV-304细胞后,均能不同程度地抑制目的基因的表达。转染后48h的real time PCR检测显示siRNA-1, siRNA-2和siRNA-3组的目的基因的表达抑制率分别为76.73%士0.768%、65.39%±0.699%、52.16%±0.014%,与阴性对照组比较均有显著性差异（p<0.05）。其中,siRNA-1的抑制作用最强。而阴性对照siRNA组与未转染抗砷细胞组比较,ABCF1 mRNA表达无明显减低（p>0.05）.Western-blot方法检测蛋白改变结果与PCR检测相互一致。噻唑兰法（MTT）进行48h NaAsO2毒性试验后,实验组细胞对急性砷染毒仍表现出较强的耐受性。结论:siRNA可特异性的抑制目的基因的表达,ABCA1基因被有效干扰后,使细胞对急性砷染毒表现出耐受性降低;抑制ABCE1和ABCF1,细胞仍表现出对急性砷染毒的耐受性,从而初步明确ABCA1基因可能是关键的抗砷基因,而ABCE1与抗砷作用相关,ABCF1对抗砷细胞的抗砷性影响不大。