人羊膜细胞的原代培养和在Ⅰ型胶原蛋白支架上的三维培养用于修复胎膜破口的研究

论文摘要

目的:建立人羊膜上皮细胞和羊膜间质细胞的分离培养和细胞纯化的方法;选择促进人羊膜细胞增殖的最佳培养基;构建人羊膜细胞/Ⅰ型胶原蛋白支架复合物以用于修复胎膜破口的研究。方法:1.通过酶消化法对羊膜上皮细胞和间质细胞进行分离和纯化。应用免疫细胞化学方法对人羊膜上皮细胞和羊膜间质细胞进行细胞鉴定。2.利用分光光度剂测定人羊膜细胞在4种不同的培养基下的细胞增殖状况。Ⅰ组:DMEM /F12+10%FBS+50.0ng/mlEGF+2.5ug/ml胰岛素+5ug/ml转铁蛋白+0.1ng/ml T3;Ⅱ组:DMEM /F12+10%FBS;Ⅲ组:DMEM /F12+50.0ng/mlEGF+2.5ug/ml胰岛素+5ug/ml转铁蛋白+0.1ng/ml T3;Ⅳ组:DMEM /F12+50.0ng/mlEGF。3.将羊膜间质细胞嵌入三维基质中,羊膜上皮细胞接种在基质的表面,构建人羊膜细胞/Ⅰ型胶原蛋白支架复合物以模拟人体羊膜组织结构。4.DAPI标记三维基质中的细胞核以计数人羊膜细胞在三维培养第2,8天的细胞数量。耦合罗丹明的鬼笔环肽染色标记可特异性地显示细胞骨架中的微丝（F-actin）结构以观察细胞在三维基质中的细胞形态。扫描电镜和透射电镜观察羊膜上皮细胞和间质细胞在三维培养中的超微结构。5.培养含有不同数量羊膜间质细胞的人羊膜细胞/Ⅰ型胶原蛋白支架复合物,15 d后检测抗张强度。结果: 1.采用胰蛋白酶和胶原酶先后消化的方法可以将羊膜上皮细胞和间质细胞进行细胞分离培养。人羊膜细胞体外培养表现出良好的细胞增殖能力和传代能力。2.羊膜间质细胞在缺少胎牛血清的培养基里缺乏增殖能力。人羊膜细胞在含有胎牛血清、表皮生长因子、胰岛素、转铁蛋白及三碘甲腺原氨酸的培养基里表现出较其余3组更强的细胞增殖能力（P<0.001）。（羊膜上皮细胞Ⅰ组:1.130±0.203;Ⅱ组:0.487±0.141;Ⅲ组:0.466±0.094;Ⅳ组:0.451±0.144。羊膜间质细胞Ⅰ组:1.356±0.173;Ⅱ组:0.930±0.112;Ⅲ组:0.200±0.053;Ⅳ组:0.190±0.029）。3.人羊膜上皮细胞和间质细胞在Ⅰ型胶原蛋白基质中的培养显示出与体内人羊膜细胞的相似性,人羊膜细胞在三维培养的过程中细胞数量无明显增加,人羊膜间质细胞可导致Ⅰ型胶原蛋白的收缩,抑肽酶和GM6001也不能抑制这种收缩。4.人羊膜细胞/Ⅰ型胶原蛋白复合物抗张强度随人羊膜间质细胞数量的增多而增强（P<0.001）。结论: 1.羊膜上皮细胞和间质细胞能够在体外分离、扩增,这为运用人羊膜细胞进行细胞治疗和组织工程技术奠定了实验基础。2.Ⅰ型胶原蛋白有望应用在人羊膜细胞组织工程,三维细胞基质培养系统有望为胎膜早破提供新的研究方法和治疗手段。

论文目录

• 符号说明
• 中文摘要
• 英文摘要
• 论文正文：人羊膜细胞的原代培养和在Ⅰ型胶原蛋白支架上的三维培养用于修复胎膜破口的研究
• 前言
• 参考文献
• 第一部分 人羊膜上皮细胞和间质细胞的分离培养
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 第二部分 人羊膜细胞在Ⅰ型胶原蛋白支架上的三维培养
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 附图
• 文献综述
• 致谢
• 攻读硕士学位期间完成的论文