论文摘要
目的:用蛋氨酸亚砜还原酶（MsrA）基因敲除小鼠（MsrA-/-）作为研究工具来研究MsrA在小鼠成长衰老过程中对整体心脏以及对离体心肌细胞的作用。同时探讨牛磺酸（Taurine）对MsrA缺失引起的心功能异常的治疗机制。建立利用高频超声仪检测实验动物正常和异常心脏功能指标的方法和体系。方法:利用Vevo 770高频超声仪检测C57BL/6品系1～2月龄野生型（WT）小鼠的心脏结构和功能,监测胎鼠9.5天～出生前的整个心脏发育过程。主要采用高频心脏超声测定、单个心肌细胞分离及电生理测定、心肌组织羰基含量测定技术,分别检测无或有口服Taurine的WT和MsrA-/-鼠心功能、心肌细胞肌节收缩性能和胞浆Ca2+动态变化、心肌细胞胞浆和线粒体蛋白氧化水平,分析MsrA缺失对心脏的影响及Taurine对心脏保护作用的机理。结果:1.建立检测WT成年鼠和胎鼠心脏形态和功能的B型、M型、脉冲多普勒、组织多普勒超声操作方法和观察体系。（1）可获得成年鼠心脏左胸骨旁长轴切面、“调整”左胸骨旁长轴切面、左胸骨旁短轴乳头肌切面、心尖四腔心切面、心尖五腔心切面B型超声图像。（2）在心腔直径最大处获得左心室M型超声图像。（3）在心尖四腔心切面二尖瓣血流处获得脉冲多普勒频谱;在二尖瓣瓣环处获得组织多普勒频谱。（4）在心尖五腔心切面主动脉瓣血流处获得脉冲多普勒频谱。（5）在“调整”左胸骨旁长轴切面左冠状动脉根部获得脉冲多普勒频谱。（6）评估心脏收缩功能的指标有EF、FS、IVCT。评估心脏收舒张功能的指标有IVRT、DT、E/A、E’/A’、E/E’,其中IVRT是测定心脏舒张功能不良的最敏感指标。另外可检测与心功能关系密切的主动脉和左冠状动脉根部血流峰速度和血流速度时间积分等指标。（7）超声检测胎鼠心脏形态和功能:E9.5为超声能观察到胚胎心脏的最早时间点;E14.5后,可获得双心室M型超声图像;E15.5为心脏超声观察完整四腔心的最佳时间点。2. MsrA缺失对心脏功能的影响。（1）超声结果显示, 1月龄和年长的MsrA-/-鼠与同年龄WT相比,其活体心脏收缩功能下降,表现为EF、FS下降和LVESD的增大。年长的MsrA-/-鼠还较同龄WT有更大的左室收缩末容积。从1月龄至年长期的成长过程中,WT的心脏收缩功能无显著变化,而年长期MsrA-/-鼠的心脏收缩功能则明显下降。（2）MsrA-/-鼠的心肌细胞肌节收缩功能异常,表现为收缩速度和幅度下降。MsrA-/-鼠的心肌对年龄增大和增高的物理频率刺激更敏感,主要表现为细胞肌节收缩幅度下降更大。MsrA-/-鼠的心肌对氧化应激更敏感,表现为H2O2处理后的MsrA-/-鼠心肌细胞肌节收缩速度和幅度显著下降。（3）MsrA-/-鼠心肌细胞胞浆Ca2+浓度出现异常,表现为胞浆Fura2比率上升速度和幅度先后下降。MsrA-/-鼠心肌细胞对年龄增大和增高的物理频率刺激更敏感,主要表现为胞浆Fura2比率上升幅度显著下降。MsrA-/-鼠心肌细胞对氧化应激更敏感,表现为H2O2处理后,胞浆Fura2比率上升速度和幅度显著下降。（4）MsrA-/-鼠心肌细胞线粒体对氧化应激更敏感,表现为正常或氧化应激后其蛋白氧化水平显著升高。3.口服5个月Taurine治疗MsrA缺失引起的心脏功能损害。（1）口服5个月Taurine期间,WT鼠心脏收缩功能呈上升趋势,但无统计学意义（P>0.05）;MsrA-/-鼠心脏收缩功能显著增加（P<0.05）,达到WT对照鼠心脏功能的相似水平。（2）Taurine能够改善因MsrA缺失所致的心肌细胞收缩功能受损,表现为口服5个月Taurine的MsrA-/-鼠肌节收缩速度显著增大（P<0.05）,接近同龄WT鼠的同类指标水平,但对肌节收缩幅度改善不大（P>0.05）。Taurine增大WT和MsrA-/-鼠的肌节基础和收缩后长度。Taurine增强心肌细胞的抗氧化应激能力,表现为口服Taurine 5个月的WT或MsrA-/-鼠心肌细胞经H2O2处理后功能无显著改变。（3） Taurine能够改善因MsrA缺失所致的心肌细胞胞浆Ca2+浓度异常,表现为口服Taurine 5个月后的MsrA-/-鼠心肌细胞Fura2比率上升速度和幅度显著增大（P<0.05）,该指标与同龄WT对照鼠相似。口服Taurine 5个月后的WT或MsrA-/-鼠在H2O2处理前后心肌细胞Fura2比率上升速度和幅度差异无显著性（P>0.05）,表明Taurine增强心肌细胞抗氧化能力,（4）Taurine能够抗氧化从而保护心肌,表现为与同龄同基因型鼠心肌细胞相比,口服Taurine 5个月后的WT或MsrA-/-鼠心肌细胞胞浆蛋白氧化水平显著降低（P<0.05）;线粒体蛋白氧化水平无差异（P>0.05）。用H2O2处理未口服Taurine和口服Taurine 5个月的MsrA-/-鼠心肌细胞,发现后者抗氧化能力增强,表现为细胞线粒体蛋白氧化水平显著降低（P<0.05）。结论:1.高频心脏超声技术是用于实验室检测成年鼠和胎鼠心脏形态和功能的一种安全,可靠,可行并无创的活体操作技术。2.在整体动物水平上,MsrA缺失可致心脏收缩功能下降。在细胞水平上,MsrA缺失可致心肌细胞肌节收缩功能下降、胞浆Ca2+浓度出现异常、对氧化应激的敏感性增高。MsrA-/-鼠心肌细胞线粒体蛋白氧化水平增高。3. Taurine可通过抗氧化作用和调节心肌细胞肌节收缩功能和胞浆Ca2+浓度对抗MsrA缺失引起的心脏损伤。Taurine使MsrA-/-鼠心肌细胞收缩功能更接近于WT鼠、整体心脏功能指标与WT鼠无显著差异。同时Taurine具有抗心肌衰老和抗高频物理刺激的作用。4.心肌细胞线粒体是对氧化应激最敏感的细胞器,在氧化应激时首先受累。Taurine能降低心肌细胞胞浆和线粒体蛋白氧化水平,达到抗氧化及对抗氧化应激产生损害从而保护心肌的目的。
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