论文题目: RNA干涉抑制NIH3T3和C4-2细胞中PC-1基因表达的实验研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 泌尿外科学
作者: 周立权
导师: 洪宝发
关键词: 前列腺癌,基因,干涉,基因沉默,小干涉,基因治疗
文献来源: 中国人民解放军军医进修学院
发表年度: 2005
论文摘要: 目的:PC-1基因（GeneBank序列号:AF202897）是由周建光等人发现并克隆的在人前列腺癌恶化程度不同细胞株中明显差异表达的新基因,本室前期研究提示PC-1基因的高表达与前列腺癌相关。为进一步研究PC-1基因的高表达与前列腺癌发生、进展的关系,初步探索PC-1基因作为前列腺癌基因治疗的候选基因的可能性,本研究拟运用RNA干涉（RNA interference,RNAi）技术抑制NIH3T3细胞中外源PC-1基因表达,筛选出PC-1基因的有效RNAi靶标,然后通过RNAi稳定抑制C4-2细胞中内源PC-1基因表达,观察对其生物学行为的影响。 方法:根据RNA干涉原理设计5段与PC-1 cDNA编码区内不同区段同源的RNA干涉靶标序列,用DNA重组技术构建可表达靶向于PC-1mRNA的shRNA的重组质粒和表达PC-1-EGFP融合蛋白的重组质粒,采用脂质体介导法将重组质粒与表达PC-1-EGFP融合蛋白的质粒共转染NIH3T3细胞,通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达差异,从5个侯选靶标中初筛出最合适的RNAi靶标,再分别通过RT-PCR和Western印迹检测PC-1mRNA和蛋白质表达水平,确认针对该靶标的RNAi抑制NIH3T3细胞中外源PC-1基因表达的效果。将表达针对此靶标的shRNA的重组质粒转染C4-2细胞,经G418筛选8周获得阳性单克隆,PCR鉴定外源DNA序列的稳定整合的克隆,RT-PCR及Western印迹鉴定稳定抑制PC-1基因表达的细胞株,MTT试验分析该细胞的生长速度,软琼脂克隆形成实验检测其非锚着依赖性生长能力。 结果:成功构建了表达分别针对PC-1编码区5个不同位置和针对与基因组序列不同源的随机序列的shRNA的重组质粒、表达针对PC-1编码区394～414位核苷酸的反义RNA的重组质粒PSCANT1和表达PC-1-EGFP融合蛋白的重组质粒pEGFP-N1-PC1(分别命名为pSC394-414、pSC421-441、pSC585-605、pSC644-644、pSC744-764、pSCNEG、pSCANT1和pEGFP-N1-PC1)。确定最有效靶标位于PC-1基因编码区的第394～414bp处。获得了稳定转染重组质粒pSC394-414的细胞株
论文目录:
中文摘要
英文摘要
前言
第一部分 RNA干涉抑制NIH3T3细胞中外源PC-1基因表达
引言
材料与方法
结果
讨论
结论
第二部分 RNA干涉技术稳定抑制PC-1基因表达对前列腺癌细胞C4-2影响
引言
材料与方法
结果
讨论
结论
参考文献
文献综述
缩略词表
攻读学位期间发表文章情况
致谢
发布时间: 2005-07-15
参考文献
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