婴儿双歧杆菌完整肽聚糖生产工艺及其抗肿瘤作用机理的研究

论文摘要

本课题研究了婴儿双歧杆菌（Bifidobacterium infantis 6069）完整肽聚糖在工业化生产条件下的提取工艺,并对提取的完整肽聚糖进行了质量及其抗肿瘤作用机理的研究,为其推广应用提供了必要的理论依据。采用发酵工程研究方法,对婴儿双歧杆菌菌株的适宜培养温度、适宜培养基、培养终点、离心条件、冷冻干燥保护剂进行了研究,确定了改良的TPY培养基,婴儿双歧杆菌菌株经培养后发酵液活菌数可达5×109cfu/mL,冻干菌粉活菌数可达2.8×1011～3.0×1011cfu/g,其增菌效果高于高密度发酵法。根据革兰氏阳性菌细胞壁结构可知磷壁酸与细胞壁通透性有很大的关系,因此,首先抽提磷壁酸使细胞膜通透性增加,有利于外界物质更好的作用于细胞和细胞内容物质更容易排出,然后脱掉胞膜上的脂肪类物质,最后用复合酶酶解细胞内的蛋白质类物质。通过试验确定完整肽聚糖提取工艺路线为:10%TCA在70℃搅拌1hr;用乙酸钠、氯仿、甲醇混合液脱脂24hrs;用浓度为2000U的胰酶和碱性蛋白酶共同处理12hrs,最后通过离心清洗去除杂质。针对改良法和Sekine法所提取的完整肽聚糖做了全面的结构和成分分析,结果表明,采用改良法所提取的完整肽聚糖其超微结构完整,氨基己糖含量为20.04 mg/g;蛋白质含量为339.6 mg/g;中性糖含量为500.01 mg/g;总脂含量为36.84 mg/g;磷含量为0.3 mg/g。实验证明,与传统Sekine法相比,改良法所获得完整肽聚糖不仅品质没有劣化,还缩短了提取时间并节约了成本。本试验通过测定脾脏指数、观察ConA促进脾淋巴细胞增殖作用、脾脏巨噬细胞吞噬中性红的能力、检测血清中IFN-γ、IL-12、TNF-α的含量、计算肿瘤生长抑制率以及肿瘤细胞中癌基因Bcl-2和抑癌基因Bax蛋白的表达程度,从而发现,婴儿双歧杆菌完整肽聚糖对试验小鼠的细胞免疫可产生有利于机体免疫功能状态的调节作用;对体外移植性小鼠肝癌H22肿瘤具有明显的抑制生长作用,其抗肿瘤的机制可能是通过增强荷瘤小鼠的免疫功能、抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡而发挥作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 双歧杆菌概述
• 1.1.1 双歧杆菌形态特性
• 1.1.2 双歧杆菌生物学特性
• 1.1.3 双歧杆菌对人体的生理作用
• 1.1.4 双歧杆菌的研究进展
• 1.2 婴儿双歧杆菌菌粉生产工艺研究
• 1.2.1 婴儿双歧杆菌菌种的选育
• 1.2.2 婴儿双歧杆菌菌种的培养
• 1.2.3 真空冷冻干燥
• 1.2.4 婴儿双歧杆菌菌粉的保藏
• 1.2.5 双歧杆菌制品的应用
• 1.2.6 双歧杆菌菌粉研究进展
• 1.3 婴儿双歧杆菌完肽聚糖
• 1.3.1 婴儿双歧杆菌完整肽聚糖（Whole Peptidoglycan,WPG）概述
• 1.3.2 婴儿双歧杆菌完整肽聚糖的提取
• 1.3.3 双歧杆菌完整肽聚糖的质量分析
• 1.3.4 双歧杆菌完整肽聚糖研究进展
• 1.3.5 抗肿瘤机理的研究
• 1.4 课题研究的目的与意义
• 1.5 课题方案的设计
• 2 婴儿双歧杆菌菌粉生产工艺研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 试验方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 菌种鉴定试验结果
• 2.2.2 菌粉生产工艺的研究
• 2.3 小结
• 3 婴儿双歧杆菌完整肽聚糖的提取及其抗肿瘤作用机理的研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 标准品的获得
• 3.2.2 不同方法对抽提磷壁酸的影响
• 3.2.3 TCA 法提取完整肽聚糖工艺的优化
• 3.2.4 形态学检查
• 3.2.5 化学组分分析
• 3.2.6 溶菌酶溶解试验结果
• 3.2.7 婴儿双歧杆菌WPG 的主要成分
• 3.2.8 不同种方法提取婴儿双歧杆菌WPG 的得率比较
• 3.3 小结
• 4 婴儿双歧杆菌动物体内外试验研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 试验材料
• 4.1.2 实验方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 卫生指标分析结果
• 4.2.2 小鼠一般状况、体重变化及胸腺指数测定结果
• 4.2.3 ConA 促进脾淋巴细胞增殖转化试验
• 4.2.4 小鼠脾脏巨噬细胞吞噬中性红能力
• 4.2.5 细胞因子IFN-γ、IL-12、TNF-α的测定
• 4.2.6 荷瘤小鼠一般状况
• 4.2.7 婴儿双歧杆菌WPG 对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响
• 4.2.8 小鼠脾指数的测定
• 22 荷瘤小鼠肿瘤生长的影响'>4.2.9 婴儿双歧杆菌WPG 对H₂₂荷瘤小鼠肿瘤生长的影响
• 22 荷瘤小鼠肿瘤细胞Bcl-2 和Bax 表达的影响'>4.2.10 婴儿双歧杆菌WPG 对H₂₂ 荷瘤小鼠肿瘤细胞Bcl-2 和Bax 表达的影响
• 4.3 小结
• 5 全文结论
• 主要创新之处
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介