杆状病毒作为椎间盘退变基因治疗载体的实验研究

论文摘要

目的:探讨杆状病毒作为椎间盘退变基因治疗载体的可行性。方法:本研究从椎间盘发生退变的形态学变化,杆状病毒介导的标志基因GFP转染正常和退变兔椎间盘髓核细胞、介导治疗基因Sox9转染退变的兔椎间盘髓核细胞等方面进行了如下实验:⑴采用共聚焦显微镜和透射电镜,对幼年和成年兔椎间盘髓核组织、细胞以及基质的形态学进行了对比观察与研究。⑵取新西兰大白兔的腰椎间盘进行髓核细胞的分离与培养,分别以6种不同浓度的重组杆状病毒（Ac/CMV/GFP）转染细胞,用荧光显微镜和流式细胞仪检测细胞的转染效率,并检测GFP基因的表达水平。分别将20μL Ac/CMV/GFP注入8只新西兰大白兔的L3-L4 L4-L5、L5-L6椎间盘髓核组织,并注射20μL生理盐水于L1-L2,而L2-L3不作任何处理进行自身对照。观察注射后兔的一般反应,分别于注射后的第7、13、20、28天各处死2只兔,进行髓核组织的切片观察。⑶取新西兰大白兔的髓核细胞进行离体培养,第一组:健康幼兔;第二组:椎间盘退变模型兔;第三组:椎间盘发生自然退变的成年兔。以200MOI的Ac/CMV/GFP转染离体培养的细胞,于第48小时采用流式细胞仪检测转染效率,同时采用HPIAS2000图像分析软件半定量分析外源性GFP基因的表达水平。⑷采用BAC-to-BAC系统构建重组杆状病毒Ac/CMV/Sox9,（Sox9是公认的能够延缓和逆转椎间盘退变的治疗基因）,用它转染离体培养的正常兔椎间盘髓核细胞,并设立Ac/CMV/GFP转染组和空白组作为对照,免疫组化的方法检测Sox9基因在细胞中的表

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩略词表
• 第一章 绪论
• 1.1 椎间盘退变与治疗
• 1.2 基因治疗椎间盘退变的研究现状
• 1.3 杆状病毒的特点及其在基因治疗中的应用
• 1.4 研究目的和内容
• 第二章 幼年与成年兔椎间盘髓核细胞的形态学差异及其意义
• 摘要
• 2.1 材料与方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 椎间盘的大体形态
• 2.2.2 髓核细胞及其基质的形态结构
• 2.2.3 髓核细胞的超微结构
• 2.3 讨论
• 第三章 Ac/CMV/GFP 安全有效的转染兔椎间盘髓核细胞
• 摘要
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 Ac/CMV/GFP 的构建及扩增
• 3.1.2 椎间盘髓核细胞的分离与培养
• 3.1.3 杆状病毒转染髓核细胞效率的确定
• 3.1.4 细胞生长与细胞活性的检测
• 3.1.5 Ac/CMV/GFP 在离体培养的髓核细胞中表达水平的检测
• 3.1.6 Ac/CMV/GFP 转染在体兔椎间盘髓核组织
• 3.1.7 统计分析
• 3.2 结果
• 3.2.1 杆状病毒对髓核细胞无毒性也不影响细胞的生存
• 3.2.2 杆状病毒的转染效率以及转染的最佳浓度
• 3.2.3 Ac/CMV/GFP 能在离体培养的髓核细胞中有效表达
• 3.2.4 Ac/CMV/GFP 在体转染兔椎间盘后的一般反应
• 3.2.5 Ac/CMV/GFP 能于在体转染的兔髓核组织中有效表达
• 3.3 讨论
• 第四章 Ac/CMV/GFP 在退变兔椎间盘髓核细胞中的有效表达
• 摘要
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 椎间盘退变的造模
• 4.1.2 细胞分组与处理
• 4.1.3 统计学方法
• 4.2 结果
• 4.2.1 椎间盘的大体形态
• 4.2.2 细胞活性检测
• 4.2.3 杆状病毒的转染效率
• 4.2.4 外源性标志基因表达水平的检测
• 4.3 讨论
• 第五章 重组杆状病毒Ac/CMV/Sox9 的构建
• 摘要
• 5.1 材料
• 5.1.1 质粒和细菌
• 5.1.2 昆虫细胞和椎间盘细胞
• 5.1.3 实验所用病毒、bacmids 和引物
• 5.1.4 主要试剂
• 5.2 方法
• 5.2.1 供体质粒pFGC-hsox9 的构建
• 5.2.2 重组hSox98acmid 的获得
• 5.2.3 重组hSox98acmid DNA 转染Sf21 细胞
• 5.2.4 病毒滴度的测定
• 5.2.5 外源性Sox9 基因表达水平的免疫组化染色
• 5.3 结果
• 5.3.1 酶切证实pFGC-hsox9 质粒中存在hSox9 基因
• 5.3.2 PCR 检测证实重组病毒Ac-hSox9 Bacmid 中含有hSox9
• 5.3.3 重组Ac-hSox9 Bacmid DNA 能够有效转染Sf21 细胞
• 5.3.4 获得高滴度的重组杆状病毒
• 5.3.5 外源性Sox9 基因能够在兔髓核细胞中表达
• 5.4 讨论
• 第六章 Ac/CMV/Sox9 调控退变兔椎间盘髓核细胞的生物学活性
• 摘要
• 6.1 材料和方法
• 6.1.1 椎间盘退变的造模与在体转染
• 6.1.2 兔椎间盘髓核组织切片和免疫组化染色
• 6.1.3 统计分析
• 6.2 结果
• 6.2.1 Ac/CMV/Sox9 能够维持兔髓核细胞的软骨细胞表型
• 6.2.2 Ac/CMV/Sox9 可促进髓核细胞Ⅱ型胶原的合成
• 6.3 讨论
• 第七章 小结
• 参考文献
• 插图彩色图片
• 综述一 杆状病毒作为基因治疗载体的研究进展
• 综述二 基因治疗椎间盘退变的进展
• 致谢
• 攻读学位期间主要的研究成果