论文摘要
急性胰腺炎是临床常见的急腹症之一,其中约10-20%的患者发展为重症急性胰腺炎（Severe Acute Pancreatitis,SAP）。SAP预后差,死亡率高达15-20%。SAP以胰腺组织的出血性坏死为主要病理特征,伴发全身炎症反应综合征（systemic inflammation response syndrome,SIRS）,后期可引发胰腺及腹腔感染。迄今为止,临床上对SAP的治疗以抑制胰酶分泌和合成,预防性应用抗生素和营养支持等保守治疗为主,缺乏特异有效的治疗方法。近期文献报道及我们前期动物实验结果提示,骨髓间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells,MSCs）参与急性胰腺炎的发病过程,动员骨髓间充质干细胞可减轻SAP病情,改善其预后。本课题以急性胰腺炎模型大鼠为研究对象,观察急性胰腺炎病程中MSCs功能变化情况,进而通过预先骨髓干预方法,研究骨髓功能状态对SAP病情的影响,并给予SAP雌性模型大鼠输注同种属雄性来源MSCs,观察移植MSCs在体“归巢”、迁移、定植、分化情况,明确MSCs在急性胰腺炎组织损伤修复中的作用及其机制。第一部分SAP和MAP动物模型制作及评估目的:制作SAP和MAP动物模型,造模后不同时间点检测胰腺炎相关评价指标,初步了解大鼠SAP模型病程规律,为下步实验选取关键时间点。方法:SAP模型制作,雄性SD大鼠,体重250-300g。无菌条件下,以3%戊巴比妥钠,按30mg/kg剂量腹腔注射麻醉并固定大鼠。于剑突下约3cm处腹壁正中,分层剪开皮毛、腹肌。循胃、十二指肠球及降部,暴露胰腺区域,找到主胰管,以24G静脉套管针于主胰管对侧肠壁刺入肠腔,稍退出针芯,循乳头将软套管穿入主胰胆管约0.5cm,动脉夹固定,另于主胰胆管上游近肝门处动脉夹钳夹。3%牛磺胆酸钠溶液30mg/kg,以微泵12ml/h速度注入。注射后拔除套管针。为保证模型制作稳定,将牛磺胆酸钠溶液中加入美兰溶液1滴,注射成功时可清晰显示胰管走行,并且蓝色溶液未漏入肠腔。轻症急性胰腺炎（MAP）模型制作,雨蛙素20ug/kg,腹腔注射,间隔1h一次,连续4次,在第一次注射后12小时造模成功。对照组大鼠仅进行假手术。在造模后0.5h、2h、4h、8h、12h、24h处死动物,检测血清淀粉酶、丙氨酸氨基转移酶、血肌酐,获取胰腺病理组织,依据schmidt评分法进行评分。观察72h三组动物存活情况。结果:对照组大鼠血清淀粉酶水平1431.2±368.5U/L。SAP组大鼠在造模后0.5小时起,血淀粉酶水平显著升高,至24小时达到高峰9980.6±2328.3U/L,造模后8h血清丙氨酸氨基转移酶161.6±215.0U/L,显著高于其余各组,血肌酐水平在造模后24h为51.4±34.06μmol/L,显著高于对照组（27.8±8.53μmol/L）（P＜0.05）。MAP组和正常对照组病理评分明显小于SAP 24h组（4.99±0.52 and 0.15±0.1 vs 8.41±0.91）（P＜0.05）。显微镜下观察对照组胰腺组织结构清晰,腺泡小叶完整,间质无渗出。MAP组6h即出现水肿和炎性浸润,造模后12h胰腺病理损害达到高峰,至第7天时胰腺炎已基本恢复。SAP组造模后即刻肉眼可见胰腺组织水肿、充血,病理评分显示,造模后0.5h病理评分即显著升高,至12—24h达到顶点。显微镜下观察,造模12h可见间质明显水肿、大量中性粒细胞浸润、散在腺泡细胞坏死,至24h可见明显的腺泡细胞坏死、腺泡小叶结构破坏、中性粒细胞浸润、出血及脂肪坏死。部分大鼠观察SAP第7天时胰腺标本,大体见胰腺组织体积明显减小,显微镜下见腺泡萎缩、增生并存。电镜照片可见24h时胰腺间质内吞噬细胞吞噬细菌,提示坏死组织已发生感染。SAP组和MAP组动物在72小时存活率分别为40%、90%,SAP组存活率显著低于MAP组。结论:雨蛙素腹腔注射和牛磺胆酸钠胰管内逆行注射分别可以诱导MAP和SAP动物模型,方法成熟,模型稳定。该SAP模型组织损伤严重,动物死亡率高,适合作为胰腺炎治疗研究对象,SAP 24h模型动物胰腺病理损害最为严重,死亡率和病情达到高峰,在后面实验中,我们选择24h为SAP模型主要观测时间点和干预治疗时间点。第二部分MSCs原代、传代培养及鉴定目的:原代培养并纯化MSCs,根据细胞表面标志物及其分化能力对MSCs进行功能鉴定,为下步实验制备MSCs产品。方法:无菌条件下,剪除大鼠双侧下肢,分离股骨,超净台上剪开骨端,10%胎牛反复冲洗髓腔至骨干发白,800rpm离心5分钟,弃上清,按5×105/cm2密度接种于含10%胎牛的DMEM+F12培养基中培养。24h内观察细胞贴壁情况,此后每12h观察细胞贴壁情况,待细胞生长至培养瓶或培养板面积80%时传代,根据细胞生长情况1:2,1:3传代。首次传代后继续定期观察,传代。传至第三代时,胰酶消化,收获细胞,并计数。分别进行流式检测和诱导分化研究。流式检测方法,将收获的MSCs分入5个离心管,每管约105细胞,分别为空白、CD29单标管、CD44单标管、CD45单标管、mix管,各管内加入相应标记抗体,避光孵育20分钟后上机检测。诱导分化方法,分别将P3代以上MSCs加入成骨、成脂、成软骨体系贴壁培养。成骨诱导2周后行茜素红染色,观察钙结节染色,成脂诱导1周后行油红染色,观察脂肪颗粒染色,成软骨诱导3周后行Ⅱ型胶原免疫组化染色并观察。对照组以普通培养基培养相同时间后,按照同样方法染色。结果:平均24-72h内MSCs贴壁,贴壁后MSCs呈纺锤形、三角形等形态,并趋向集落样生长,经过传代培养,细胞组份逐渐得到纯化,至第三代（P3）时,细胞形态单一,MSCs占90%以上。流式检测结果显示,原代培养细胞有多个细胞群,主要有CD29+CD44+CD45-,CD29+CD44-CD45+,CD29+CD44-CD45-等,其中CD29+CD44+CD45-群为MSCs细胞群,经过传代培养,CD29+CD44+CD45-群所占比例逐渐增大,细胞群组成趋于单一,至P3代时,CD29+CD44+CD45-群达到95%以上。经成骨诱导分化,MSCs茜素红染色阳性,可见大量红色钙结节沉着。经成脂诱导,MSCs油红染色阳性,可见散在红色染色的脂肪滴。经成软骨诱导,MSCsⅡ型胶原染色阳性。对照组结果均为阴性。结论:本部分实验建立了稳定的MSCs原代、传代培养方法。获得的MSCs经贴壁传代培养,纯度达95%以上,流式鉴定结果显示为Lin-CD29+CD44+-CD45-细胞群。通过对该细胞群进行三系诱导分化,结果显示,MSCs可以向三系分化,为下部分实验提供了充足的MSCs产品。第三部分SAP时MSCs功能状态分析目的:分析SAP不同时间段内MSCs功能状态情况。方法:胰管内逆行注射牛磺胆酸钠法制作SAP动物模型（方法同第一部分）,在造模后12h、24h、36h处死动物,获取动物骨髓细胞,离心后弃上清,按105/cm2密度接种于含10%胎牛的DMEM+F12培养基的24孔板或培养瓶中培养。24h内观察细胞贴壁情况,此后每12h观察细胞贴壁情况,待细胞生长至80%时传代,根据细胞生长情况1:2,1:3传代。首次传代后继续定期观察,传代。传至第三代时,胰酶消化,收获细胞,应用流式细胞仪进行检测（方法同第二部分）。平板克隆法计算克隆形成率,获取动物骨髓细胞,按105cm2密度接种于24孔板或培养瓶中培养,连续观察,至出现肉眼可见细胞集落,弃除培养基,PBS冲洗,结晶紫染色10-15分钟,流水冲洗,计算肉眼可见克隆集落数目。分化能力分析,P3代以上MSCs胰酶消化收获后,分别加入成骨、成脂、成软骨体系贴壁培养,诱导分化（方法同第二部分）。对照组大鼠未行胰腺炎造模,仅进行假手术,检测分析方法同上。结果:SAP组MSCs平均贴壁时间短于对照组,SAP12h、24h、36h克隆形成率均显著高于对照组（P＜0.05）。SAP不同时间点获取的原代培养MSCs数量差异有显著性,SAP 36h获取MSCs经原代培养,Lin-CD29+CD44+CD45细胞比例显著低于对照组（P＜0.05）。SAP组和对照组MSCs均可以三系诱导分化。结论:在SAP不同时间段,MSCs数量和增殖能力发生了改变,可能经历了先增加,再减少的过程。尽管MSCs增殖能力改变,SAP大鼠骨髓MSCs表面CD29、CD44、CD45表达无明显变化。SAP时MSCs具有三系分化潜力。SAP病程对MSCs功能产生影响,增殖的MSCs可能参与了SAP病程。第四部分骨髓干预处理对SAP病情的影响目的:观察骨髓动员及骨髓抑制预处理对SAP病情的影响。方法:实验动物为雄性SD大鼠,按照随机数字法分入正常对照组、骨髓抑制组（busulfan）、骨髓动员组（G-CSF）、SAP组、骨髓抑制-SAP组（busulfan-SAP）,骨髓动员-SAP组（G-CSF-SAP）。骨髓动员处理以中性粒细胞集落刺激因子（G-CSF）,100μg/kg,腹腔内注射,2h后胰管内逆行注射牛磺胆酸钠法制作骨髓动员—SAP模型。骨髓抑制处理以白消安注射液,1mg/100g,腹腔内注射,6h后胰管内逆行注射牛磺胆酸钠法制作骨髓抑制—SAP模型。对照组为未进行骨髓干预的健康SD大鼠。骨髓抑制组和骨髓动员组在骨髓干预后2h,获取动物血液标本,检测血淀粉酶,制作血涂片,获取胰腺组织标本,HE染色后进行病理评分,取双侧股骨,制作骨髓涂片。血涂片和骨髓涂片进行瑞氏—姬姆萨染色,油镜下观测,对有核细胞计数。骨髓干预—SAP模型在SAP造模后12h,处死动物,检测血清淀粉酶,获取胰腺病理组织,依据schmidt评分法进行评分。观察72h三组动物存活情况。结果:骨髓动员组、骨髓抑制组和正常对照组相比,血淀粉酶水平、胰腺组织病理评分无明显差别。外周血涂片结果显示骨髓抑制组外周血有核细胞数量显著减少,高倍镜视野下罕见,骨髓涂片结果显示骨髓抑制组骨髓有核细胞数量中度减少,可见轻度纤维化征像。骨髓动员—SAP组、骨髓抑制—SAP组、SAP组大鼠血淀粉酶水平无明显差别,三组胰腺组织病理评分总分无明显差别,骨髓抑制—SAP组胰腺腺泡坏死单项评分高于另两组。骨髓抑制—SAP组大鼠72h生存率为0,显著低于骨髓动员组70%和SAP组40%（P＜0.05）。流式细胞检测结果显示,骨髓抑制组Lin-CD29+CD44+CD45细胞比例小于骨髓动员组。结论:G-CSF、白消安注射液分别能够动员或抑制大鼠骨髓MSCs。骨髓抑制—SAP组大鼠72h生存率显著下降。提示MSCs功能状态与SAP病情相关,MSCs可能在SAP时发挥保护作用,促进损伤修复。第五部分同种异体MSCs移植对SAP的治疗作用及其机制目的:观察MSCs移植对SAP的治疗作用,进而初步探讨其机制。方法:获取雄性SD大鼠MSCs,传代培养（方法同第二部分）。制作雌性SD大鼠SAP动物模型（方法同第一部分）。造模后24h输注P3代以上MSCs,约5-7×107/只。输注后24h处死动物,获取血液、骨髓、胰腺、肺脏、肝脏、脾脏、心脏、肾脏等病理标本。MSCs在体鉴定,抽提脏器组织DNA,PCR法检测Y染色体sry片段。MSCs荧光标记在体鉴定,获取MSCs细胞悬液,约107/ml,CFSE染液染色,37%孵育5分钟,荧光显微镜观察后输注SAP大鼠。输注治疗24h后获取上述标本,血液标本经红细胞裂解液处理,流式检测CFSE阳性细胞。骨髓悬液荧光显微镜下观察。组织标本行HE染色或免疫组化染色后荧光显微镜下观察。抽提胰腺组织、肺脏组织RNA,SYBERGREEN法相对实时定量RT-PCR检测TNF-α,IL-1βmRNA表达。免疫组化法检测MSCs爬片标本、SAP未输注治疗组胰腺病理切片、输注治疗后胰腺病理切片SHH抗原表达。输注治疗后胰腺病理切片免疫荧光检测SHH、CFSE染色双标记阳性细胞,检测CK19、CFSE染色双标记阳性细胞。观察输注治疗组和SAP未输注治疗组72h生存情况。结果:输注治疗组胰腺、肺脏、肝脏、心脏、肾脏组织可以检测sry基因片段。输注治疗后24h骨髓细胞悬液可见CFSE染色细胞。输注治疗组血液标本流式检测未见CFSE染色细胞。输注治疗组胰腺、肺脏TNF-α,IL-1βmRNA表达显著低于SAP未治疗组（P＜0.05）。输注治疗组72h生存率高于SAP未治疗组。MSCs爬片标本、未输注治疗SAP胰腺病理切片SHH表达阴性,输注治疗后胰腺病理切片SHH表达阳性,主要集中于炎症损伤较重的腺泡及导管部位。输注治疗组胰腺病理切片可见SHH、CFSE阳性重叠区域,未见明显CK19、CFSE双标阳性细胞。结论:MSCs移植治疗可以降低SAP模型大鼠胰腺、肺脏TNF-α,IL-1βmRNA表达水平,提高SAP模型大鼠生存率。移植的MSCs可以“归巢”至骨髓,迁移至胰腺炎症损伤部位。贴壁培养MSCs和未经治疗的胰腺炎组织不表达SHH,输注治疗后,胰腺炎组织SHH表达阳性,并且存在SHH、CFSE阳性重叠区域。提示SHH参与了MSCs迁移或分化过程。全文小结:本课题采用胰管内注射牛磺胆酸钠法,成功制作实验性SAP大鼠模型,通过对SAP病情指标评估,确定24h为治疗干预时间点。应用贴壁法,对正常状态和SAP状态MSCs进行原代和传代培养,发现SAP不同阶段MSCs数量和增殖能力经历了先升高再降低的过程。应用骨髓干预措施改变MSCs功能状态,结果显示MSCs抑制的SAP大鼠病情加重,死亡率提高,提示MSCs在SAP时可能发挥保护作用。进而应用同种异体MSCs移植治疗SAP,提高了SAP模型大鼠生存率。免疫组化结果提示MSCs迁移及促进SAP组织损伤修复机制可能与SHH信号通路相关。