猪伪狂犬病病毒蛋白激酶基因的克隆和生物信息学分析

论文摘要

将四川农业大学动物生物技术中心保存Fa株、疫苗株783株、Bartha株和SA215株,四川野毒株SN株、SS株、SO株、SL株和SCZ株,以及由韶关学院英东生物工程学院娄高明教授惠赠的北京株BJ株、广东株DG、湖北株HS株共计12株伪狂犬病病毒株,应用PCR技术扩增得到了PRV完整的PK基因的片段12条。回收PCR产物,成功连接转化到感受态细胞E.coli DH5a中。并通过菌落PCR和酶切鉴定正确后,送生物公司进行测序。将所的12条序列连同GenBank中登录的6条PK基因全序列共18条基因序列,使用生物软件对它们的基因序列的同源性、突变区域的定位、遗传进化关系、酶切位点的差异、密码子偏爱性,氨基酸序列的同源性、蛋白质亲水性、抗原表位分析、二级结构、蛋白质结构功能域等生物信息学的内容进行预测和分析。同时,对疱疹病毒属的单纯疱疹病毒Ⅰ型、单纯疱疹病毒Ⅱ型、牛疱疹病毒Ⅰ型、马疱疹病毒Ⅰ型以及水痘带状疱疹病毒进行PK基因的同源性和结构功能域的分析。结果表明:PRV-PK基因的开放阅读框的核苷酸长度在1107～1170nt,氨基酸长度在369～390个之间,核酸同源性为96.7%～100%,氨基酸的同源性在73.9%～100%之间,在PK基因核酸序列1079～1099bp和240～250bp处有两个高变重复区,不同毒株基因均对GC极为偏爱。毒株间基因内酶切位点、蛋白质亲水性、抗原表位和蛋白质高级结构预测等内容的分析结果十分相似,说明PRV-PK基因具有很高的保守性。疱疹病毒的核苷酸同源性在2.2%～51.5%之间,氨基酸同源性在8.2%～39.3%之间。在PK基因编码的蛋白质序列中,发现具有真核细胞丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶氨基酸亚结构域特征序列,而且疱疹病毒PK基因具有一些特征性的、共有的氨基酸序列。该研究从病原、分子水平、生物信息等方面对PRV-PK基因进行了研究,对于PRV的流行病学研究及诊断和防治具有重要意义。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 目录
• 第一章 文献综述
• 1.伪狂犬病毒研究进展
• 1.1 PRV病原
• 1.2 PRV的分子生物学
• 1.2.1 PRV的基因组
• 1.2.2 伪狂犬病毒的蛋白及其功能
• 1.2.3 伪狂犬病毒的毒力基因
• 1.3 伪狂犬病的诊断
• 1.3.1 病原学诊断技术
• 1.3.2 血清学诊断技术
• 1.4 伪狂犬病的防治
• 2.伪狂犬病病毒PK基因研究进展
• 2.1 PK基因的分子生物学
• 2.2 PK基因的功能
• 3.生物信息学的应用
• 3.1 生物信息学在病毒研究中的应用
• 3.2 多重序列对齐
• 3.3 预测序列的高级结构
• 3.4 蛋白质分子进化分析
• 4.实验意义
• 第二章 伪狂犬病病毒蛋白激酶基因的克隆
• 2.1.材料
• 2.1.1 细胞,菌株和毒种
• 2.1.2.主要试剂
• 2.1.3 溶液的配制
• 2.1.4 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 病毒的增殖
• 2.2.2 病毒DNA的提取
• 2.2.3 PCR扩增
• 2.2.4 PCR产物的克隆
• 2.2.5 测序
• 2.3 结果分析
• 2.3.1 PCR扩增
• 2.3.2 菌落PCR
• 2.3.3 重组质粒PCR法鉴定
• 2.3.4 质粒酶切
• 2.4 讨论
• 第三章 伪狂犬病病毒蛋白基因的生物信息学分析
• 3.1 材料
• 3.1.1 生物信息在线分析网站
• 3.1.2 生物信息分析软件
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 核苷酸序列同源性分析
• 3.2.2 核苷酸遗传进化树分析
• 3.2.3 PRV-PK基因的多重序列比对
• 3.2.4 PRV-PK基因核苷酸序列酶切位点分析
• 3.2.5 PK基因核苷酸序列密码子分析
• 3.2.6 氨基酸序列同源性分析
• 3.2.7 PK基因氨基酸进化树分析
• 3.2.8 PK基因编码蛋白质多重序列比对
• 3.2.9 PK基因编码蛋白质基本特性分析
• 3.2.10 PRV-PK蛋白质结构预测
• 3.2.11 PK基因编码蛋白质基本性质分析
• 3.2.12 PRV—PK蛋白质结构功能分析
• 3.2.13 疱疹病毒PK蛋白结构功能域分析
• 3.2.14 PRV-PK蛋白抗原表位预测
• 3.3 结果分析
• 3.3.1 核苷酸序列同源性分析
• 3.3.2 PK基因核苷酸序列遗传进化树分析
• 3.3.3 PRV-PK基因的多重序列比对
• 3.3.4 PRV-PK基因核苷酸序列酶切位点分析
• 3.3.5 PRV-PK基因核苷酸序列密码子分析
• 3.3.6 氨基酸序列同源性分析
• 3.3.7 PK基因氨基酸进化树分析
• 3.3.8 PK基因编码蛋白质多重序列比对
• 3.3.9 PK基因编码蛋白质基本特性分析
• 3.3.10 PRV-PK蛋白质结构预测
• 3.3.11 PK基因编码蛋白质基本性质分析
• 3.3.12 PRV-PK蛋白质结构功能分析
• 3.3.13 疱疹病毒PK蛋白结构功能域分析
• 3.3.14 PRV-PK蛋白抗原表位预测
• 3.4 讨论
• 3.4.1 关于PRV-PK基因的核苷酸序列分析
• 3.4.2 关于PK基因所编码的蛋白质的分析
• 3.4.3 关于伪狂犬病病毒PK蛋白质的功能
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士期间在公开杂志发表的文章