蛋白质组学研究相关技术的发展及其在大鼠海马细胞膜蛋白质组研究中的应用

论文题目: 蛋白质组学研究相关技术的发展及其在大鼠海马细胞膜蛋白质组研究中的应用

论文类型: 博士论文

论文专业: 生物化学与分子生物学

作者: 陈平

导师: 梁宋平

关键词: 蛋白质组,方法学,磺基异硫氰酸苯酯,从头测序,海马,细胞质膜,生物素,亲和纯化,磷酸化位点

文献来源: 湖南师范大学

发表年度: 2005

论文摘要: 蛋白质组学研究主要依赖三大技术:蛋白质组分离技术、蛋白质组鉴定技术以及利用生物信息学对鉴定的蛋白质进行结构和功能分析与预测。蛋白质组学的发展既为技术所推动也受技术所限制,蛋白质组学研究成功与否,很大程度上取决于其技术方法水平的高低,因此发展高通量、高灵敏度、高准确性的研究技术平台即蛋白质组学方法学研究是当今乃至相当一段时间内蛋白质组学研究中的主要任务之一。本文在蛋白质组学方法学研究方面进行了一系列探索,首先建立并优化了肽质量指纹图(PMF)分析方法;在此基础上对MALDI-TOF源后衰变(PSD)从头测序(de novo sequencing)方法进行了探索,在比较了化学辅助磺酸化修饰试剂3-磺酸丙酸N-羟基琥珀酰胺酯后,提出了一种新型的化学辅助磺酸化修饰试剂磺基异硫氰酸苯酯(SPITC),对包括缓冲液、盐浓度、反应温度和时间在内的各种衍生条件进行了摸索与优化,并将该方法成功地运用于中药复方861对肝星状细胞影响的蛋白质组学研究以及HT-1080人纤维肉瘤细胞的蛋白质组学研究中,对2D-胶分离的肝星状细胞蛋白质点以及1D-胶分离的人纤维肉瘤细胞蛋白质条带的酶解肽片段进行了序列测定,得到了可靠的结果。该磺酸异硫氰酸苯酯(SPITC)辅助的de novo sequencing方法具有测定成本低廉、操作简单易行、结果准确可信的优点;与传统的串联质谱MS/MS测序方法相比较,该方法得到的图谱只包含简单的y+离子系列,背景干净、信躁比高,极大地解决了质谱de novo测序中图谱复杂、解析困难的难题;结合PMF方法,能准确地鉴定来自2D胶的蛋白质点,甚至对于1D-PAGE分离的混合蛋白质点也能毫不含糊地鉴定。该方法在蛋白质组学上的发展和应用将极大地提高蛋白质鉴定的准确度和可靠性。此外,还对MALDI-TOF质谱结合羧肽酶Y消化进行蛋白质和多肽C端de nove sequencing方法进行了摸索和优化,采用对不同浓度和不同时间间隔混合样品取样的方法,通过测定消化后肽片段所形成的梯度式分子量,得到了一次测定C端20个氨基酸序列的结果。在此基础上,对磷酸化肽的分离及鉴定也进行了初步研究,采用MALDI-TOF结合磺基异硫氰酸苯酯(SPITC)辅助的从头测序方法,将用固相金属离子亲和色谱柱

论文目录:

缩写表(中英文对照)

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英文摘要

第一章 综述——蛋白质组学研究技术进展

1.蛋白质组研究中的样品制备技术

1.1 蛋白质的分步抽提技术及亚细胞分级分离技术

1.2 磁式分离技术

1.3 激光捕获显微切割技术

2.蛋白质组研究中的样品分离技术

2.1 二维凝胶电泳技术

2.2 多维色谱技术

2.3 毛细管电泳技术

3.蛋白质组研究中的样品鉴定技术

3.1 蛋白质组研究中质谱仪器的最新进展

3.2 蛋白质组研究中以质谱为基础的分离鉴定技术最新进展

第二章 蛋白质组学鉴定技术方法学研究

第一节 肽质量指纹图分析方法的建立与优化

第二节 MALDI-TOF源后衰变从头测序方法学研究之一 3-磺酸丙酸N-羟基琥珀酰胺酯修饰

第三节 MALDI-TOF源后衰变从头测序方法学研究之二 磺基异硫氰酸苯酯(SPITC)修饰

第四节 MALDI-TOF质谱测定多肽C端序列方法的建立

第五节 SPITC化学辅助方法鉴定磷酸化肽修饰位点

第三章 大鼠海马细胞质膜的蛋白质组研究

第一节 生物膜蛋白质组学研究的意义和背景

第二节 海马组织细胞质膜的蛋白质组研究

第三节 细胞质膜的生物素化亲和纯化方法的建立

第四节 海马细胞质膜的蛋白质组鉴定

第四章 主要研究结果与进一步研究设想

论文发表情况

专利申请受理通知书

致谢

原创性声明

发布时间: 2005-08-29

参考文献

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