论文摘要
目的泪腺肿瘤是眼眶较为常见的肿瘤之一，严重影响患者的外观，其良性肿瘤容易复发和恶变，恶性肿瘤生存率低。泪腺肿瘤的发生发展与多种基因功能的改变密切相关，是一个复杂的多步骤的过程，包括原癌基因的激活（如cerbB-2）和抑癌基因的突变或丢失（如P53）等。Ras相关区域家族1A（RASSF1A）是美国学者Dammann R于2000年从3号染色体短臂（3p21.3）上克隆出来的新型候选抑癌基因，研究发现该基因与肺癌、食管癌及前列腺癌等多种腺癌的发生、发展密切相关，目前国内外尚无关于该基因和泪腺肿瘤的关系的研究。本实验采用逆转录多聚酶链反应（reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR）方法和Western blot方法从转录水平和蛋白表达水平检测和分析了正常泪腺组织和泪腺肿瘤组织中RASSF1A基因表达的差异，观察RASSF1A基因在泪腺组织中的转录和表达水平的变化情况，以期发现泪腺肿瘤早期诊断的方法，检测泪腺良性肿瘤术后复发的高危人群，指导泪腺恶性肿瘤病人术后的辅助治疗，提高患者生存率。材料和方法1标本与分组本研究随机选取郑州大学第一附属医院眼科自2004年9月～2007年4月住院手术病人41名。其中男性21例，女性20例，年龄33～73岁，平均年龄49岁。因为化疗、放疗对RASSF1A的表达是否有影响还不清楚，所以均选取单一手术病人。同时根据患者的病理组织学检查结果，将所取标本进行分组。泪腺良性肿瘤患者的标本21例，分为泪腺良性肿瘤组织组；泪腺恶性肿瘤患者的标本10例，分为泪腺恶性肿瘤组织组；眼眶深部肿瘤组织患者其泪腺组织病理组织学检查表现正常者及开放性眼眶损伤患者所切除的损伤部位泪腺共10例，分为泪腺正常组织组。2实验方法取各组标本0.2克离体半小时内，立即置入液氮罐速冻，然后保存于-80℃冰箱中备用。用RT-PCR检测泪腺肿瘤组织及正常泪腺组织中RASSF1A mRNA的表达，比较其差异性，即取0.1克标本提取其组织中的总RNA，并通过电泳和紫外线分光光度仪鉴定总RNA的完整性及纯度。对mRNA定量后进行RT-PCR扩增，以β-actin（β-肌动蛋白）作为内参照。RT-PCR扩增产物进行电泳分离，应用凝胶成像系统观察电泳cDNA条带，并使用凝胶成像分析软件对结果进行相对定量分析。同时采用Western blot方法检测RASSF1A基因的蛋白半定量表达情况，提取组织中的总蛋白，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，半干转转膜封闭，一抗鼠抗人RASSF1A抗体孵育，二抗羊抗鼠IGg抗体孵育，DAB显色试剂盒显色。3观察项目与指标RT-PCR结果以mRNA指数（RI）作为表达水平参数，即RASSF1A RI=RAS--SF1A mRNA/β-actin mRNA，以（?）±s记录实验结果。Western blot结果根据显色条带的强弱，记录阴性表达和阳性表达的例数，统计结果。4统计学分析采用SPSS11.0软件系统进行分析，计量资料采用独立样本t检验，计数资料采用Fisher’精确检验。判定标准为P＜0.05为有统计学差别。结果1 RT-PCR结果1．1各组RASSF1A校正值正常泪腺组织、良性肿瘤组织以及恶性肿瘤组织中RASSF1A校正值（RASSF1A/β-actin）分别为0.4240±0.1890、0.2943±0.1605、0.0810±0.0595。1．2正常泪腺组织组与良性泪腺肿瘤组织组比较良性肿瘤组织与正常泪腺组织相比，RASSF1A mRNA水平差异有统计学意义，良性肿瘤组织中RASSF1A基因转录水平明显低于正常组织（t=3.703，P＜0.05）。1．3正常泪腺组织组与恶性泪腺肿瘤组织组比较恶性肿瘤组织与正常泪腺组织相比，RASSF1A mRNA水平差异有统计学意义，恶性肿瘤组织中RASSF1A基因转录水平低于正常组织（t=18.222，P＜0.05）。1．4良性泪腺组织组与恶性泪腺肿瘤组织组比较良性肿瘤组织与恶性肿瘤组织相比，RASSF1A mRNA水平差异有统计学意义，恶性肿瘤组织中RASSF1A基因转录水平低于良性肿瘤组织（t=11.331，P＜0.05）。1．5结合临床资料和随访结果分析RASSF1A mRNA的表达值与泪腺肿瘤复发的关系良性肿瘤组中1例mRNA的表达值为RI=0.1030（接近恶性肿瘤的表达量），术后复发。恶性肿瘤组中，1例RASSF1A的mRNA的表达值为RI=0.3095（处于泪腺良性肿瘤组织的表达量区间），无术后复发史，其余9例RASSF1A的mRNA表达值位于0.0810±0.0595区间，1例术后无复发，2例复发，6例随访丢失。2 Western blot结果2．1各组蛋白表达结果正常泪腺组织、良性泪腺肿瘤组织及恶性泪腺肿瘤组织均可检测RASSF1A蛋白，正常泪腺组织全部RASSF1A蛋白表达呈现强阳性（+++），良性泪腺肿瘤组织11例呈强阳性表达，4例呈中度阳性表达，6例呈弱阳性表达；恶性泪腺肿瘤组织1例呈强阳性表达，2例呈中度阳性表达，7例呈弱阳性表达。恶性泪腺肿瘤组织中RASSF1A蛋白的表达程度明显低于良性泪腺肿瘤组织，组间比较具有显著性差异（P＜0.01）。2．2结合临床资料和随访结果分析RASSF1A蛋白表达与泪腺肿瘤复发的关系良性肿瘤组中1例RASSF1A蛋白表达弱阳性，术后复发。恶性肿瘤组中，1例蛋白表达强阳性，无术后复发史，其余9例RASSF1A蛋白表达阴性者中，1例术后无复发，2例复发，6例随访丢失。结论1 RASSF1A mRNA水平在正常泪腺组织中较高，良性泪腺肿瘤组织中稍低，恶性泪腺肿瘤组织中更低，三者之间两两比较，差异均有统计学意义。正常泪腺组织、良性泪腺肿瘤组织及恶性泪腺肿瘤组织均可检测出RASSF1A蛋白，但蛋白表达强弱不同，三者之间两两比较，差异亦具有统计学意义。2良、恶性泪腺肿瘤组织中RASSF1A基因在转录水平和蛋白表达水平上均低于泪腺正常组织（P＜0.05），RASSF1A基因参与了泪腺肿瘤的生长分化，可以阻止正常泪腺组织中细胞异常增生，而缺乏RASSF1A可能引起肿瘤生长。3在转录水平和蛋白表达水平，泪腺恶性肿瘤组织中的RASSF1A基因表达均低于泪腺良性肿瘤组织（P＜0.05），RASSF1A基因的低表达可能是正常泪腺组织及泪腺良性肿瘤组织恶变的机制，其转录水平下调和蛋白表达降低与泪腺组织恶性转化相关。4 RASSF1A表达弱的肿瘤，复发机率较高，提示RASSF1A在泪腺肿瘤中的低表达可能抑制由多种刺激包括放疗化疗引起的细胞凋亡而使肿瘤细胞的寿命延长，而这些逃脱凋亡的细胞可能导致了肿瘤的不断生长和复发。
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