伪狂犬病病毒gE基因在大肠杆菌中的表达

论文摘要

伪狂犬病病毒是疱疹病毒科、α-疱疹病毒亚科的成员，可以引起猪、牛、羊及野生动物的伪狂犬病（又称Aujeszky氏病），猪是该病毒的天然宿主、也是主要感染源。伪狂犬病给养猪业造成了巨大经济损失，其危害仅次于猪瘟和口蹄疫。作为主要的诊断抗原，伪狂犬病病毒糖蛋白E（glycoprotein,gE）在伪狂犬根除计划中发挥重要的作用。为获得大量的、成本较低的诊断抗原，本研究利用大肠杆菌表达系统对伪狂犬病病毒gE主要抗原区域进行了表达，为gE-ELISA试剂盒的研制提供一定的理论依据和借鉴。本研究主要内容：根据GenBank中伪狂犬病毒gE基因序列，设计了一对引物，PCR扩增长度为558bp的gE基因去信号肽后的主要抗原区域（157-714bp），将其克隆进测序载体PGEM-Teasy中，成功构建质粒PGEMTeasy-gE。用BamhI和HindⅢ将gE基因主要抗原区域从PGEM-Teasy中切出，然后与同样酶处理的原核表达载体pet32a连接，命名为pet-gE。在IPTG的诱导后，经SDS-PAGE电泳发现43ku处出现特异性蛋白条带。研究了目的蛋白表达量与各个培养条件的关系，优化后的最佳表达条件为IPTG浓度为1mM，诱导时间为5小时时的蛋白表达量最大。经过western-blot分析，表达产物具有很好的抗原性。该研究成功表达出具有抗原性的目的蛋白，为血清学鉴别诊断方法gE-ELISA的建立打下很好的基础，同时gE-ELISA也能对野毒和疫苗毒进行鉴别。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 伪狂犬病病毒研究进展
• 1.1.1 病原学
• 1.1.2 病毒囊膜与糖蛋白
• 1.1.3 病毒感染和复制
• 1.1.4 潜伏性
• 1.2 伪狂犬病病毒的诊断学研究进展
• 1.2.1 病毒分离（Ⅵ）
• 1.2.2 动物接种试验
• 1.2.3 电镜技术
• 1.2.4 血清学检测方法
• 1.2.5 分子生物学检测技术
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌种和载体
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 主要溶液配方
• 2.2 方法
• 2.2.1 引物的设计与合成
• 2.2.2 PRV Min-A株DNA的提取
• 2.2.3 PCR扩增
• 2.2.4 PCR扩增产物的凝胶电泳
• 2.2.5 PCR扩增产物的回收
• 2.2.6 目的片段与载体的连接
• 2.2.7 感受态细胞的制备
• 2.2.8 连接产物的转化
• 2.2.9 碱裂解法小量提取质粒
• 2.2.10 重组质粒的鉴定
• 2.2.11 原核表达载体的构建
• 2.2.12 重组质粒的诱导表达
• 2.2.13 最佳诱导条件的确定
• 2.2.14 表达产物的检测
• 3 结果
• 3.1 PCR扩增结果
• 3.2 重组质粒PET-gE的鉴定结果
• 3.2.1 重组质粒的酶切鉴定
• 3.2.2 重组质粒的PCR鉴定
• 3.2.3 重组质粒的序列测定
• 3.3 表达产物的SDS-PAGE电泳检测
• 3.3.1 不同IPTG浓度的诱导表达
• 3.3.2 不同时间的诱导表达
• 3.4 Western-blot分析
• 4 讨论
• 4.1 本研究的必要性
• 4.2 实验中遇到的困难与问题
• 4.3 gE-ELISA的优点
• 4.4 伪狂犬病的根除
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文