慢性乙型肝炎组织病理学指标及病毒X基因变异与患者预后的相关性研究

论文摘要

前言 据统计，在全世界的慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染者中，我国约占一半。对慢性乙型肝炎的基础研究和临床诊疗一直是我国重点。以往对HBV的研究主要集中在血清学方面，由于HBV在血清和肝组织中其病毒状态、抗原的含量、血清型和基因型、病变程度等方面均存在显著差异，难以直观地反应病变的状态和严重程度，所以肝活体组织检查越来越成为必要手段，在诊断潜在病变和早期纤维化，最终诊断或除外HBV感染方面有着不可替代的作用。目前，肝穿刺活检已相当普遍，但对肝穿刺结果的判定、各项检测指标之间的相互关系及和预后的联系，还缺乏系统性评估。 随着分子生物学技术的发展，病毒变异在HBV致病与致癌中的作用越来越引起关注，特别是X基因及其蛋白。X基因是HBV基因组内功能重叠最明显的区域，其编码的X蛋白具有广泛的反式激活作用，目前被认为是研究HBV致病与致癌作用机制的突破口。以往对X基因及蛋白变异的研究多采用血清标本或在体外细胞水平进行，与体内肝细胞中的实际情况有一定差距。肝组织内X基因的变异与各组织病理学指标之间的关系以及对疾病转归的影响还未见报道。 近年来，在对肝细胞癌发生机制的研究中，抑癌基因启动子的高甲基化越来越引起人们的关注。虽然许多研究证实，肝细胞癌中p16INK4A的高甲基化可被普遍检出，且HBV感染能显著增加肝组织p16INK4A甲基化比率，从而使p16蛋白低表达或不表达，在肝细胞癌形成早期起了重要作用，但其中的机制并不明确。最新体外研究提示，HBV的病毒蛋白和病毒变异可能与此过程有关，但在人体条件下这种相关性是否存在，结果也有待进一步证实。 本研究一方面以较大临床肝穿刺样本作为研究对象，通过对慢性乙型肝炎组织病理学指标（如Scheuer评分、乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）、核心抗原（HBcAg）、e抗原（HBeAg）和X蛋白（HBx蛋白）的原位表达，单位肝组织内HBV DNA含量）和X基因变异的回顾性研究，明确它们之间的相互关系及与患者预后的联系，找到可用于肝穿刺活检的病理辅助诊断指标，对慢性乙型肝炎患者的预后加以评估及指导临床诊疗；另一方面在组织水平研究了HBV病毒蛋白（包括HBsAg、HBcAg和HBx蛋白）以及X基因的变异与p16INK4A甲基化之间的关系，为HBV介导的肝细胞癌形成机理的研究提供新方向。 第一部分 HBV相关组织病理学指标和慢性乙型肝炎患者预后的相关性研究 目的：通过对慢性乙型肝炎肝穿刺标本中组织病理学指标和患者预后的回顾性研究，明确各指标间的相互关系及和患者预后的联系。 方法：对216例肝穿刺活检病例进行预后随访，时间为2～18年。根据随访结果，按有无肝细胞癌的发生首先将患者分为两组：癌变组和非癌变组；非癌变组患者又按有无肝硬化的发生分为硬化组和非硬化组；最后非硬化组患者按血清谷丙转氨酶（ALT）水平分为ALT波动组和ALT正常组。肝脏病理损伤程度用Scheuer评分来表示；免疫组化En Vision二步法检测肝组织HBsAg、HBcAg、HBeAg和HBx蛋白的表达；荧光实时定量PCR检测单位肝组织内HBV DNA的含量。 结果：相关分析结果显示：肝组织内HBeAg的表达与慢性肝炎炎症分级（G分级）呈显著正相关（P=0.001）；HBx蛋白的表达与G分级（P=0.008）和纤维化分期（S分期）（P=0.002）均呈显著正相关。部分指标预后组间也存在差异：硬化组G分级显著高于非硬化组（P=0.000），ALT波动组显著高于ALT正常组（P=0.019）；同样，硬化组S分期也显著高于非硬化组（P=0.000），ALT波动组显著高于ALT正常组（P=0.001）；肝组织内HBeAg（P=0.005）和HBx蛋白（P=0.024）的表达在硬化组明显比非硬化组高。方差分析结果还显示HBeAg和HBx蛋白的表达对预后的影响具有协同作用：同一病例中两者肝组织内同时表达将大大增加慢性乙型肝炎患者肝硬化的发生率达38.46％，而单一HBeAg或HBx蛋白表达者为15.07％，两者均阴性者仅为10.81％。多元参数的最优尺度回归则显示Scheuer评分是最重要的判断预后的指标。 结论：肝组织内HBeAg和HBx蛋白的表达与慢性乙型肝炎患者肝脏病变的严重程度呈正相关，并显著增加肝硬化的发生率；Scheuer评分是判断患者预后的最重要指标，其分值越高则患者预后越差。 第二部分 HBV X基因变异与HBV相关组织病理学指标和慢性乙型肝炎患者预后的相关性研究 目的：研究慢性乙型肝炎患者肝组织内HBV X基因部分区段的变异与各组织病理学指标的关系，及其在预后转归（特别是肝硬化和肝细胞癌发生）中的作用。 方法：选取1986～1994年间有完整预后随访资料的83例慢性乙型肝炎肝穿刺活检病例作为研究对象。患者按有无肝细胞癌和肝硬化的发生分为3组：癌变组、硬化组和非硬化组。另取20例HBV相关性肝细胞癌作为对照研究。从福尔马林固定、石蜡包埋组织中抽提DNA，聚合酶链反应（PCR）扩增HBV X基因nt1583～1793区段，目的条带经胶回收后直接双向测序。免疫组化En Vision二步法显示肝组织内HBsAg、HBcAg、HBeAg和HBx蛋白的表达；荧光实时定量PCR检测单位肝组织HBV DNA含量；数据处理采用序列分析软件和统计软件。 结果：PCR扩增的目的片段长211bp，核苷酸突变发生于：nt1632、1633、1635、1636、1652、1673、1674、1719、1726、1727、1730、1752、1762和1764位点，其中错义突变主要出现在X蛋白aa87（nt1632、1633）、88（nt1635、1636）、116（nt1719）、118（nt1726、1727）、119（nt1730）、127（nt1752）、130（nt1762）和131（nt1764）位氨基酸。统计分析结果显示，检测区段核苷酸突变率和患者慢性乙型肝炎病史呈显著正相关（P=0.005），肝癌病例的突变率显著高于慢性肝炎（P=0.009）；nt1725～1730（aa118／119）突变与肝组织内HBcAg显著低表达（P=0.006），和HBV DNA低拷贝数（P=0.004）明显相关，尤以ACTGAC（TD）型突变最为明显；相反nt1762／1764（aa130／131）位点突变则伴肝组织内HBcAg显著高表达（P=0.005）和高水平的HBV DNA含量（P=0.006）。硬化组和非硬化组中各位点野生型和突变型所占比率均未见显著性差异；但癌变组nt1762／1764（aa130／131）突变率显著高于非癌变患者（P=0.011）；nt1725～1730（aa118／119）野生型（P=0.024）和nt1762／1764（aa130／131）突变型（P=0.001）在肝癌组所占比率均明显高于慢性肝炎。 结论：nt1725～1730（aa118／119）和nt1762／1764（aa130／131）突变可能与肝组织内HBcAg的表达和HBV的复制有关。HBV相关肝细胞癌中病毒以高复制型存在。HBV的突变是一个逐渐累积的过程，突变和肝硬化的发生无关，而nt1762／1764（aa130／131）突变能显著增加慢性乙型肝炎患者肝细胞癌的发生机率。 第三部分 HBV相关组织病理学指标和X基因变异与p16INK4A甲基化的相关性研究 目的：通过研究HBV相关组织病理学指标及X基因的变异与p16INK4A甲基化状态之间的关系，明确病毒对p16INK4A甲基化的影响和其在HBV相关肝细胞癌形成中的作用。 方法：选取23例HBV相关肝细胞癌和25例慢性乙型肝炎肝穿刺活检病例作为研究对象，癌与癌旁组织以及肝穿组织中p16INK4A的甲基化状态采用甲基化特异性PCR（MSP）进行检测。免疫组化En Vision二步法显示肝组织内HBsAg、HBcAg、HBeAg和HBx蛋白的表达；荧光实时定量PCR检测单位肝组织HBVDNA含量。HBV X基因的变异用PCR扩增和直接序列测定来检测。 结果：在癌旁组织（P=0.025）和慢性乙型肝炎（P=0.029）病例中，存在p16INK4A甲基化的病例其肝组织内HBx蛋白的表达明显高于非甲基化病例。但在肝癌组织中，HBx蛋白的表达与p16INK4A甲基化无关。在所有肝组织中，HBsAg、HBcAg和组织HBV DNA含量均与p16INK4A甲基化状态无关。 结论：在癌前病变中，p16INK4A甲基化与HBx蛋白高表达显著相关。提示HBx蛋白可能诱导p16INK4A甲基化而使该抑癌基因失活，在HBV相关肝细胞癌形成中起了重要作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 参考文献
• 第一部分 HBV相关组织病理学指标和慢性乙型肝炎患者预后的相关性研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第二部分 HBV X基因变异与HBV相关组织病理学指标和慢性乙型肝炎患者预后的相关性研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• INK4A甲基化的相关性研究'>第三部分 HBV相关组织病理学指标和X基因变异与p16^INK4A甲基化的相关性研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 综述
• 在读期间撰写论文及获奖
• 致谢