转Bt基因稻谷对小鼠健康的安全性评价

论文摘要

本论文通过五个试验研究转Bt（Bacillus thuringiensis）基因稻谷中所表达的crylAc杀虫蛋白对小鼠的体内血清生化指标、胚胎生长发育、脏器指数、小鼠小肠mtDNA突变的影响；以及外源基因和外源蛋白质在小鼠体内残留程度与转基因稻谷的潜在致敏性,旨在为评价转Bt基因稻谷的食用安全性提供科学依据,并获得了如下主要结果：试验1转Bt基因稻谷对小鼠血清生化指标和器官发育的影响试验将80只6周的小鼠随机分成两个处理组,每个处理4个重复,每个重复10只小鼠（5只公鼠,5只母鼠）,对照组饲喂同一品种的非转基因稻谷日粮（C组）,试验组饲喂转基因稻谷日粮（Bt组）。试验期90d,90d时每个重复随机抽取5只小鼠,眼球静脉取血,测定血常规血生化指标;取血后处死,测定重要器官指数;其中小肠、肝脏、肺脏和脾脏做成显微切片观察病理变化,结果表明实验组和对照组血常规血生化指标正常,重要器官指数未见显著差异,肝脏、肺脏和脾脏切片未见明显病理变化,但小肠切片表明实验组小鼠小肠腺细胞产生了病变性增生。试验2转Bt基因稻谷对小鼠胚胎生长发育的影响将试验一的雄雌大鼠按1：1合笼,每天对雌鼠进行阴道涂片检查,以发现精子之日为妊娠0d,于妊娠20d处死孕鼠进行剖检。然后对妊娠小鼠体重增加观察各组于妊娠的0、4、8、12、16、20 d称重,观察体重的变化。对妊娠小鼠生殖能力检查观察并记录胚胎称重、着床数、活胎数、死胎数、吸收胎数。活胎逐一检查记录性别、体重、身长、尾长及外观有无畸形。将每窝1／2胎仔用茜素红染色,检查骨骼项目。将每窝1／2胎仔用Bouin氏液固定2周,用徒手切片法作内脏检查。结果表明转Bt基因稻谷对孕鼠孕期体重增长没有影响,活胎仔肉眼外观检查结果表明,头部、四肢、尾、躯干、面部、腭、唇均无畸形。用放大镜按顺序检查各脏器大小、形状及位置,Bt组和对照组均未见异常。试验3转Bt基因稻谷的致敏性生物信息学预测用三维结构比较工具比对后发现,Bt毒素蛋白和多种常见的细菌毒素如大肠杆菌素A（ColicinA）、白喉毒素（Diphtheria）具共同的三维构象特征,都含有由多个疏水的和亲水亲脂α-螺旋组成的α-螺旋束,其长度足以跨过双层脂膜,具有相似的穿孔机制。据此预测转Bt基因稻谷具有致敏性可能,具体情况有待于进行实验研究。试验4取食转Bt基因稻谷的小鼠小肠mtDNA突变的研究选定mtDNA的mtDNA 12S RNA和16S RNA全序列片段引物,共设计4对引物,扩增4个mtDNA序列PCR产物条带,将DNA测序结果与线粒体基因库中的小鼠mtDNA序列对比,得到所有食用转Bt基因稻谷小鼠小肠标本中一致性的2个有意义的点突变,造成了原来位置上氨基酸的改变,分别为337G＞C （His→Asp）和1771G>T（Asn→Lys）。对于实验结果中2个一致性突变,推测它们可能起到协同作用,突变的积累使得线粒体功能出现异常,从而导致小鼠出现小肠腺细胞病变性增生。试验5转基因稻谷中外源基因和外源蛋白质在小鼠体内残留的检测随着转基因植物在饲料中的应用,人们对转基因植物中重组DNA及其表达的目的蛋白质是否会转移到动物产品中越来越关注。本试验以转Bt基因的抗虫水稻的稻谷配成日粮饲喂小鼠,90 d时随机抽取5只,无菌条件下心脏取血,以肝素钠抗凝;处死,无菌条件下取小鼠的肝脏、肾脏、脾脏、小肠、腿肌。采用一对crylAc基因特异的引物,以转基因稻谷中的crylAc基因的229 bp片段为PCR扩增体系和扩增条件的阳性对照,以小鼠内源GAPDH基因340 bp片段为DNA提取效果阳性对照,对血液、肝脏、肾脏、脾脏、小肠、腿肌的DNA进行PCR扩增,检测是否有crylAc基因229 bp片段残留或转移,结果未扩增出该基因的特异性片段。以转基因稻谷配制的小鼠日粮为阳性对照,采用ELISA法检测小鼠粪便、肝脏、肾脏、脾脏、小肠、和腿肌是否有由crylAc基因表达的抗虫蛋白的残留,结果表明转基因稻谷日粮中的外源基因所表达的抗虫蛋白crylAc在体内被降解,其小分子片段随粪便排出体外,最终并未在小鼠的内脏器官和肌肉中累积。综上所述,通过本文系列研究发现以转Bt基因稻谷作为小鼠饲料,在实验期间,被饲喂90d的小鼠不仅未发现产生外观不安全和不健康的性状,而且对小鼠亲代和子代的血清生化指标及其器官的发育均无明显影响；也未发现转基因成分在小鼠体内会发生转移和残留,由此可见,以转Bt基因稻谷作为小鼠的饲料基本上是安全的。然而小鼠小肠产生了肠腺细胞病变性增生现象,且mtDNA检测出2个有意义的突变点,上述结果是否由Bt毒蛋白所致有待进一步研究。本研究不但为转基因植物的安全性评价提供了重要的科学数据,而且也为转基因稻谷作为人类食物的安全性评价提供有意义的借鉴。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 绪论
• 1 转Bt基因抗虫植物
• 2 Bt杀虫蛋白作用机理
• 3 转基因植物作为食物和动物饲料可能存在的安全性问题
• 4 研究问题的提出及拟研究的内容
• 第二章 实验研究
• 试验1 取食转Bt基因稻谷的小鼠对其血清生化指标和器官发育的影响
• 1 材料和方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 试验2 转Bt基因稻谷对小鼠胚胎生长发育的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 试验3 转Bt基因稻谷对小鼠的致敏性生物信息学预测
• 1 方法与步骤
• 2 结果
• 3 讨论
• 试验4 取食转Bt基因稻谷的小鼠小肠线粒体mtDNA序列的检测
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 试验5 转基因稻谷中外源基因和外源蛋白质在小鼠体内残留的检测
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 4 小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读硕士期间所发表的论文
• 致谢