鹿卵母细胞体外培养与体外受精的超微结构研究

论文摘要

胚胎的体外生产是一个庞杂的技术体系,而卵母细胞体外培养是成功实施体外胚胎生产必不可少的关键性技术环节。目前国内外关于鹿胚胎生物工程的研究尚处在起步阶段,鹿卵母细胞超微结构的研究属该领域诸多研究空白之一。本研究以马鹿为试验材料,开展了鹿卵母细胞超微结构的研究。对母马鹿用FSH进行超排处理后,通过抽吸法和切割法采集卵巢卵母细胞,用M199为基础的培养液在38.5℃、5%CO2和饱和湿度条件下对鹿卵母细胞进行体外培养与体外受精培养,利用光镜和透射电镜对体外成熟培养前、后及受精后的鹿卵母细胞及卵母细胞内细胞器的形态及超微结构进行研究。结果表明: 1.光镜下,马鹿卵母细胞成熟培养前直径大于培养后直径,分别为172.997±17.271μm与161.311±5.721μm。 2.电镜下,马鹿成熟培养前卵母细胞内线粒体长径为0.60±0.11μm,短径为0.49±0.12μm;培养后长径为0.77±0.13μm,短径为0.66±0.11μm;受精后长径为0.59±0.05μm,短径为0.46±0.05μm。脂滴在成熟培养前、后和受精后直径为1.55±0.08μm、1.02±0.46μm、1.27±+0.43μm。空泡成熟培养前长径为0.87±0.35μm,短径为0.65±0.30μm;培养后长径为1.30±0.45μm,短径为1.04±0.41μm;受精后长径为0.69±0.08μm,短径为0.60±0.09μm。 3.电镜下,成熟培养前卵丘紧紧包围鹿卵母细胞,卵母细胞表面的微绒毛细长,伸入透明带内,皮质区及细胞中心分布大量的细胞器。 4.成熟培养后的卵丘细胞与鹿卵母细胞结合松散,卵母细胞表面的微绒毛短粗,倒伏于卵表面,皮质颗粒在皮质区成层排列,细胞质中细胞器分布均匀。 5.受精后鹿卵母细胞表面的微绒毛由倒伏而竖起,第一极体无核,第二极体有核,卵母细胞质中细胞器丰富,主要分布于细胞中心。 6.细胞器的分布规律是随着鹿卵母细胞的成熟,高尔基复合体、线粒体、皮质颗粒等细胞器数量不断增加,并由细胞中心逐渐迁移到皮质区,最后散在分布于整个胞质中。 7.鹿卵母细胞内各种细胞器的体积随着卵母细胞的成熟发育而增大,在卵母细胞受精后体积又随之减小。 本研究获得的鹿卵母细胞体外成熟培养前、后及受精后的形态及超微结构的研究结

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 前言
• 2 文献综述
• 2.1 卵母细胞形态和结构的一般特征
• 2.2 卵母细胞的超微结构
• 2.2.1 卵丘细胞
• 2.2.2 卵母细胞质膜和透明带
• 2.2.3 卵母细胞质
• 2.2.3.1 内质网
• 2.2.3.2 线粒体
• 2.2.3.3 高尔基复合体
• 2.2.3.4 皮质颗粒
• 2.2.3.5 色素颗粒
• 2.2.3.6 卵黄颗粒
• 2.2.3.7 环形片层
• 2.2.4 卵母细胞核
• 2.3 卵母细胞超微结构的研究现状
• 2.3.1 家畜卵母细胞超微结构的研究现状
• 2.3.1.1 牛
• 2.3.1.2 羊
• 2.3.1.3 猪
• 2.3.2 实验动物卵母细胞超微结构的研究现状
• 2.3.3 野生动物卵母细胞超微结构的研究现状
• 2.4 研究的手段
• 2.5 研究的目的和意义
• 3 材料与方法
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 试验动物的来源
• 3.1.2 主要的试验仪器、设备
• 3.1.3 主要的试验试剂
• 3.1.3.1 超数排卵用试剂
• 3.1.3.2 卵母细胞体外培养、受精用试剂
• 3.1.3.3 电镜样品制备用试剂
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 母鹿的超数排卵
• 3.2.2 卵巢的采集与保存
• 3.2.3 卵母细胞的采集
• 3.2.4 卵母细胞的成熟培养
• 3.2.5 卵母细胞的体外受精
• 3.2.6 卵的测量
• 3.2.7 透射电镜样品的制作
• 3.2.7.1 取样
• 3.2.7.1 缓冲液的配制
• 3.2.7.2 固定液的配制
• 3.2.7.2.1 戊二醛固定液的配制
• 3.2.7.2.2 锇酸固定液的配制
• 3.2.7.3 固定
• 3.2.7.4 脱水
• 3.2.7.5 浸透
• 3.2.7.6 包埋
• 3.2.7.7 切片和染色
• 3.2.7.8 观察和拍照
• 3.2.8 卵母细胞内细胞器的测量
• 3.3 卵母细胞的活力评定
• 3.3.1 显微镜直接观察法
• 3.3.2 超微结构评定标准
• 3.3.3 测量数据统计
• 4 试验结果
• 4.1 鹿卵母细胞的一般形态
• 4.2 鹿卵母细胞的超微结构
• 4.2.1 培养前鹿卵母细胞的超微结构
• 4.2.2 培养18小时的鹿卵母细胞的超微结构
• 4.2.3 成熟的鹿卵母细胞的超微结构
• 4.2.4 鹿受精卵的超微结构
• 4.3 鹿卵母细胞的测量
• 4.4 卵丘细胞的测量
• 4.5 鹿卵母细胞内细胞器的测量
• 4.5.1 线粒体
• 4.5.2 脂滴
• 4.5.3 空泡
• 4.5.4 皮质颗粒
• 5 分析与讨论
• 5.1 光镜下卵母细胞的外部形态
• 5.2 卵母细胞直径的变化
• 5.3 卵丘细胞的变化
• 5.4 微绒毛的变化
• 5.5 线粒体的变化
• 5.6 高尔基体和皮质颗粒的变化
• 5.7 脂滴和空泡的变化
• 5.8 细胞核的变化
• 6 结论
• 参考文献