防风组织培养及其发根体系建立方法的研究

论文摘要

本研究采用防风种子作为外植体,获得无菌苗,采用正交设计,筛选防风组织培养各阶段的最适培养基,研究了（1）防风（Saposhnikovia divaricata （Turcz.）Schischk.）的组织培养及植株再生体系。（2）发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）的生理生化法检测及分子生物学鉴定、生物活力大小比较。（3）发根农杆菌R10001对防风遗传转化条件的研究及发根体系的建立。结果如下:在无菌系建立时采用种子作为外植体,剥去种皮,纸桥法（1/2MS）播种,污染率可降至13.3%,出芽时间缩短到7d,出芽率达到65.2%（自然情况下防风出苗仅为50%,出芽时间40-60d不等）,出芽率提高了15.2%,出芽时间提前了30-50d;防风叶片外植体在MS+2,4-D0.6+6-BA0.5（单位mg/L,下同）的培养基上7d即可见愈伤产生,出愈率达100%,较茎段、根、下胚轴外植体出愈率高,且愈伤组织块大,生长旺盛;愈伤组织增殖的最佳培养基为:MS+6-BA1.0+NAA0.6,30d后增殖倍数达到13.68倍,6-BA、NAA对愈伤组织增殖作用达到极显著水平。KT对愈伤组织增殖作用不显著;MS +NAA0.6+KT0.5+6-BA1.0是适合防风愈伤组织芽分化的最佳培养基,芽分化率达到70.0%;不定芽在MS+NAA0.4培养基上产生的根白色、较粗壮,生根率达100%,当根长至34cm、苗高5 cm左右时即可进行炼苗移栽。生理生化法检测供试的7个菌株,R1025、R1601、R10001为生物Ⅱ型发根农杆菌,与PCR检测结果（R10001、R1025、R1601在540bp、770 bp附近有明显条带）相一致。YEB液体培养基培养15h时,菌株密度（OD600）大小依次为R1601>R10002 >LBA9402>ATCC15834>R1025> R10001>A4。利用黄瓜刚展开子叶测定供试菌株的遗传转化活力,结果显示R10001的遗传转化率最高,达到59.0%,外植体生根数平均4.21条。除菌抗生素的选择以Cef 400mg/L为宜。防风发根诱导适宜外植体为幼叶,预培养培养基采用MS +2,4-D0.6+6-BA0.5+AS30,侵染前超声波处理适宜时间为4s,侵染后共培养适宜天数为2d,发状根诱导率可达62.9%。将除至无菌的防风发状根用MS液体培养基培养,测定生长曲线,在5～20d生长很快,随着培养时间延长,35d以后,发状根褐化严重,至35～40d发根生长进入平台期,增长缓慢。防风发根在MS+2,4-D0.6+6-BA0.5的培养基上可形成愈伤组织,而在添加NAA0.6mg/L、KT0.5 mg/L和6-BA1.0 mg/L部分愈伤组织能分化出不定芽。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词
• 第一章 引言
• 1.1 研究的目的和意义
• 1.2 国内外研究动态
• 1.2.1 防风的国内外研究进展
• 1.2.2 发根农杆菌和发状根的研究进展
• 第二章 防风组织培养的研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 外植体的制备
• 2.1.2 培养基及培养条件
• 2.1.3 愈伤组织的诱导
• 2.1.4 愈伤组织的继代增殖
• 2.1.5 不定芽的诱导
• 2.1.6 不定芽的生根诱导及移栽成苗
• 2.1.7 数据统计
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 外植体的制备
• 2.2.2 愈伤组织的诱导
• 2.2.3 愈伤组织的继代培养
• 2.2.4 愈伤组织不定芽的分化
• 2.2.5 不定芽生根诱导及出瓶移栽
• 2.3 讨论
• 2.4 结论
• 第三章 发根农杆菌的鉴定与活力比较
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 发根农杆菌的生长曲线测定
• 3.2.2 发根农杆菌的抗生素抑菌试验
• 3.2.3 发根农杆菌的生理生化法检验
• 3.2.4 PCR 检测结果
• 3.2.5 生物活力检测结果
• 3.3 讨论
• 3.4 结论
• 第四章 发根农杆菌对防风遗传转化的研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 不同因素对防风发状根诱导的影响
• 4.2.2 防风发状根生长曲线测定
• 4.2.3 防风发状根PCR 检测
• 4.3 讨论
• 4.4 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历
• 在读期间发表论文情况