分泌型多肽TAT-CT3-cMyc对白血病HL-60细胞的生长调节

论文摘要

白血病是造血系统的恶性疾病。近几年,研究人员提出,应该从分子角度重新认识白血病,开展针对信号分子激活/抑制的研究,为白血病的防治提供新的思路和方法。白血病抑制因子（Leukemia inhibitory factor, LIF）是一种多功能的、作用广泛的细胞因子,为IL– 6细胞因子家族的一员,能够在体外抑制粒系白血病细胞（如人HL-60、U937、小鼠M1系等）的增殖。然而,由于白血病细胞增长快速并对LIF感应能力很差,机体内有限的LIF无法有效抑制白血病细胞的生长[1]。而外源性、非生理剂量的LIF对脂肪细胞、生殖细胞和内分泌细胞等正常细胞具有显著的细胞毒性,同时干扰了细胞因子间的正常协调作用,所以LIF目前还无法直接用于疾病治疗。进一步研究显示,LIF的生物学效应是通过结合靶细胞膜上的LIF受体（LIFR）来实现的。LIFR包括两个亚基--LIFRα（gp190）和LIFRβ（gp130）。其中,LIFRα含有1239个氨基酸,胞外区由789个氨基酸构成,跨膜区由26个疏水氨基酸组成,胞内区由238个氨基酸构成。LIFRα的胞内区共有三个功能域（Box1、Box2和Box3）,其主要作用结构为YXXQ（Y为酪氨酸,X为任意氨基酸,Q为谷氨酰胺）,是激活细胞内信号分子的必须序列[2]。本教研室前期工作中已证实,通过脂质体转染的方式,将LIFRα细胞内区全长序列（LIFRα-CT）和含Box3功能域的C末端序列（LIFRα-CT3）分别富集于人类急性早幼粒白血病细胞HL-60胞质中,可促进该系白血病细胞的粒细胞方向分化,并有效抑制其增殖潜力[4-9]。但无论是脂质体还是病毒等转染方式,均只能应用于体外试验,因此,研发可用于体内将LIFRα-CT3安全、高效地导入白血病细胞的方法显得非常有意义。近年研究发现,蛋白质转导结构域（Protein Transduction Domain, PTD）可将全长蛋白质、DNA、化学药物、寡核苷酸、40 nm磁珠和200 nm脂质体等[10]携带入细胞/核。目前最常用的PTD是人类免疫缺陷I型病毒（HIV-1）来源的TAT蛋白片段（TAT-PTD）,它具有短小、高效、无毒、快速、不影响下游分子生理功能的优良特性,但常用的原核表达体系得到的融合蛋白因缺乏转录后的剪切、翻译修饰,存在低/无生物活性的可能性[11-14]。因此,要获得有活性的TAT-PTD融合蛋白需用真核表达系统。本课题的目的就是利用真核表达系统制备有活性的LIFRα-CT3融合蛋白,并通过蛋白质转导结构域（PTD）将LIFRα-CT3携带入白血病胞内/核内,观察其对白血病细胞系HL-60的作用,并探讨其机制。为此,我们采用基因重组的方法,将LIFRα-CT3、TAT-PTD、出胞信号肽（Signal Sequence,ss）和融合标签cMyc克隆入真核表达载体pcDNA3.0中,成功构建了pcDNA3.0-ss-TAT-CT3-cMyc重组表达载体和对照载体pcDNA3.0-ss-CT3-cMyc;通过FuGENE 6非脂质体转染法将两种载体分别转染入中国仓鼠卵巢细胞（CHO）中,RT-PCR、免疫印迹和免疫荧光检测显示,TAT-CT3-cMyc可在CHO细胞中转录和表达,表明TAT-CT3-cMyc的真核表达系统已建立成功;进一步利用Realtime-PCR筛选获得了高表达的CHO-TAT-CT3-cMyc细胞系。接着,我们将构建好的CHO-CT3-cMyc和CHO-TAT-CT3-cMyc两个细胞系大量扩增后,更换为无血清培养液,72h后,回收培养液和超声粉碎CHO细胞后的上清, 0.45μm滤器过滤后,利用抗cMyc标签凝胶包被的蛋白层析柱纯化目的蛋白,SDS-PAGE电泳检测显示,纯化获得的目的蛋白正确,且纯度高（大于95%）,BCA定量检测得知,共获得732μg的TAT-CT3-cMyc多肽和569μg的CT3-cMyc多肽。最后,将获得的TAT-CT3-cMyc多肽和CT3-cMyc多肽分别按终浓度10μg/ml、30μg/ml和50μg/ml加入到人早幼粒白血病细胞系HL-60的培养基中,观察其对细胞生长和分化的影响,并探索可能涉及的信号转导通路。免疫荧光检测显示,作用时间1h时,TAT-CT3-cMyc多肽组HL-60细胞内可见明显阳性反应,但10μg/ml组荧光强度较弱,30μg/ml组和50μg/ml组可见强阳性反应。灰度分析提示,30μg/ml组和50μg/ml组的荧光强度无明显差别,这表明TAT-CT3-cMyc确可将融合蛋白片段带入HL-60细胞内,并富集于胞核,且作用时间1h,剂量30μg/ml是较理想的条件。免疫荧光检测还证实,TAT融合多肽进行转导时,其阳性率在80%以上,荧光强度在30min1h内即可达到峰值,此后随时间延长而下降,至8h左右时,荧光强度已非常弱,但仍可检测到。流式细胞术检测显示,30μg/ml TAT-CT3-cMyc多肽作用8h的HL-60细胞,CD14和CD11b的表达在72h时明显增高,表明TAT-CT3-cMyc多肽确有促进HL-60细胞朝成熟粒细胞方向分化的功能。CCK-8细胞增殖检测显示,与野生型和添加了CT3-cMyc多肽的HL-60细胞相比,添加了TAT-CT3-cMyc多肽（30μg/ml,连续暴露4天,每天8h）的HL-60细胞增殖明显下降,表明TAT-CT3-cMyc多肽的连续应用对HL-60细胞的增殖有明显抑制作用。免疫印迹检测显示,在不添加Jak2抑制剂（AG-490）的情况下,TAT-CT3-cMyc多肽组的HL-60细胞中,pSTAT3的水平最高;添加了Jak2抑制剂后,TAT-CT3-cMyc多肽组的HL-60细胞中,pSTAT3分子仍有较清晰的表达,表明TAT-CT3-cMyc组的pSTAT3是由TAT融合多肽在不依赖于Jak2分子的情况下独立激活的。为了证实TAT-CT3-cMyc组HL-60细胞的分化确实是由STAT3分子激活引起的,我们在各组添加了STAT3抑制剂,并再次在蛋白水平检测了CD14/CD11b的表达。结果显示,3组细胞的CD14/CD11b表达量均有一定程度的减低但TAT无差别,表明pSTAT3的表达量与HL-60细胞的分化程度呈正相关。激光共聚焦显微镜观察发现,与野生型和CT3-cMyc多肽组HL-60细胞相比,TAT-CT3-cMyc多肽组HL-60细胞中tSTAT3和荧光pSTAT3的表达明显增强,表明TAT-CT3-cMyc多肽可以促进HL-60细胞内信号分子STAT3的聚集和激活,启动STATs相应的信号转导通路。总之,本研究构建了pcDNA3.0-ss-TAT-CT3-cMyc真核表达载体,首次建立了TAT-CT3-cMyc融合蛋白真核表达系统,纯化获得了高纯度且有生物学活性的TAT-CT3-cMyc融合蛋白,并首次发现,TAT-CT3-cMyc融合蛋白可以在短时间内（<1h）高效进入白血病细胞HL-60内,并通过不依赖Jak2的途径激活STAT3磷酸化,促进急性髓系白血病细胞向成熟细胞方向分化并抑制其增殖。这为进一步利用TAT-CT3-cMyc融合蛋白靶向治疗白血病提供了技术支持和理论依据。关键词:白血病抑制因子,信号转导,STAT3,中国仓鼠卵巢细胞,cMyc标签蛋白,TAT蛋白转导结构功能域小结1、TAT-CT3-cMyc融合蛋白可以高效进入白血病细胞HL-60内,促进急性髓系白血病细胞向成熟细胞方向分化。2、TAT-CT3-cMyc融合蛋白在白血病细胞HL-60内游离存在时,可以以独立于Jak2分子的情况下,激活STAT3磷酸化信号通路,影响其增殖与分化进程。3、通常情况下只能用原核表达系统制备的TAT融合蛋白在本试验中采用真核表达体系CHO也能大量制备,且在额外添加了信号肽序列后可以分泌出胞,纯化后仍有生物学活性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 第一部分 重组人TAT-CT3-cMyc 及对照片段的CHO 细胞株的获得与鉴定
• 前言
• 一、材料与方法
• 二、结果
• 三、讨论
• 参考文献
• 第二部分 分泌型多肽TAT-CT3-cMyc 及对照片段的纯化与鉴定
• 前言
• 一、材料与方法
• 二、结果
• 三、讨论
• 参考文献
• 第三部分 分泌型多肽TAT -CT3-cMyc 对HL-60 细胞的生长调节作用
• 前言
• 一、材料与方法
• 二、结果
• 三、讨论
• 参考文献
• 全文小结
• 创新点
• 综述一 蛋白转导穿膜域的现状与未来
• 参考文献
• 综述二 精原干细胞研究进展
• 参考文献
• 在读期间论文发表和科研工作情况说明
• 一、攻读学位期间发表的学术论文
• 二、攻读学位期间参加科研工作情况
• 三、博士研究生期间参加学术会议及培训情况
• 致谢