羟基喜树碱磁性热敏脂质体的制备及药效学评价

论文摘要

目的高强度聚焦超声（High intensive focused ultrasound, HIFU）技术作为一种使用于恶性肿瘤的非侵入性的无创热疗新技术。不仅副作用小,而且治疗效果明显。磁性热敏脂质体是近年来兴起的一种可以同时发挥热疗与化疗作用的靶向药物载体,较普通脂质体,具有更强的组织靶向性和热控释特性。将两者联合应用于肿瘤的治疗,一方面既能在HIFU治疗下,杀伤肿瘤局部的大部分肿瘤细胞；另一方面,同时可以将引导至肿瘤局部的磁性热敏脂质体在HIFU加热条件下,释放药物,实现对肿瘤细胞的二次杀伤,进而达到肿瘤治疗的最佳效果。本研究以羟基喜树碱（Hydroxycamptothecin, HCPT）作为主药,探索羟基喜树碱磁性热敏脂质体的制备工艺,评价磁性热敏脂质体的相关质量项目以及靶向性、热敏性和细胞毒性等相关指标,最后联合新型热疗技术-高强度聚焦超声技术,考察两种技术联合使用的抗肿瘤效果。方法1样品HPLC分析方法的建立运用HPLC法同时检测羟基喜树碱开环结构和闭环结构的含量,对色谱条件进行优化,并进行方法学考察。2羟基喜树碱磁性热敏脂质体的制备及质量评价选择适当的制各方法和材料制备磁性热敏脂质体,并通过正交试验,优化制备工艺,对制备得到的HCPT磁性热敏脂质体进行包封率、载药量、粒径形态以及磁靶向性和热敏性的评价。3HCPT磁性热敏脂质体的细胞毒性试验考察由于HCPT对肝癌具有较好的治疗作用,因此以肝癌Huh-7细胞株为考察对象,采用MTT比色法,比较HCPT磁性热敏脂质体组、HCPT注射液组对肿瘤细胞的抑制情况,计算抑制率,考察以上两者的抗肿瘤活性以及各组不同浓度水平的抗肿瘤情况。4考察HCPT磁性热敏脂质体联合HIFU技术治疗荷瘤小鼠在昆明种小鼠皮下植入肝癌细胞H22型细胞株,造成皮下肿瘤模型。设立（1）空白对照组；（2）HCPT注射液组；（3）单纯HIFU治疗组：肿瘤表面不加磁场；（4）单纯HCPT磁性热敏脂质体组：肿瘤表面添加铷铁硼磁钢作为外加磁场；（5）HCPT磁性热敏脂质体联合HIFU组。尾静脉给药,给药后每天量取荷瘤小鼠模型瘤径,观察肿瘤生长状况,评价治疗效果。结果1建立了样品HPLC分析方法根据药物性质,建立了一种既能检测HCPT开环结构和闭环结构的色谱条件,并对该色谱条件进行方法学考察。结果表明开闭环结构在该色谱条件下分离情况良好,对称性好,线性范围及精密度、稳定性、回收率等均符合实验要求。2羟基喜树碱磁性热敏脂质体的制备及质量评价通过对制备方法和制备材料进行筛选,本实验选择天然大豆卵磷脂和胆固醇为载体材料,按照薄膜分散-超声法制备,通过正交试验进行筛选、优化,得到粒径为268nm,包封率为41.8%,载药量为1.32%,热敏性表现为60min脂质体的释放量大于50%,并具有良好磁靶向性HCPT磁性热敏脂质体,其最佳工艺处方为：药脂比为1：30,大豆卵磷脂：胆固醇为8：3,制备温度：42℃,水化介质：pH6.8PBS,亲油性Fe3O4的用量为HCPT:磁粉（w/w）为1：1～1.5。3HCPT磁性热敏脂质体的细胞毒性试验考察HCPT的自制磁性热敏脂质体与注射液作为实验组,比较两者在不同浓度水平的抑瘤率,考察对肝癌细胞的抗肿瘤活性,实验组均对肝癌细胞有杀伤作用,而且随着浓度的增加,其抑制作用增强。在相同浓度条件下,HCPT磁性热敏脂质体组对肿瘤细胞的抑制率明显高于HCPT注射液组,基本符合羟基喜树碱的开环结构的抗肿瘤活性低王闭环结构的理论事实。4考察HCPT磁性热敏脂质体联合HIFU技术治疗荷瘤小鼠按照皮下种植肝癌H22型细胞株,经过调整细胞数量和植入体积,可以得到瘤径均匀的动物模型。在考察HCPT磁性热敏脂质体的抗肿瘤活性中,发现该磁性热敏脂质体给药组对比空白组的小鼠,给药组的小鼠瘤径变化幅度缓和,而且抑制肿瘤的生长。在联用试验中,各个给药组对肿瘤均有抑制效果,其中给予HIFU治疗的2个实验组出现逐步的死亡,而导致无法考察其最终的治疗效果。结论1HCPT脂质体制备工艺研究薄膜分散法适用于HCPT脂质体的制备。在HCPT脂质体在磷酸盐缓冲液储存过程中,脂质体在室温条件下较在4℃环境下的稳定性差,甚至出现絮状分层现象。脂质体的储存要注意环境因素对其稳定性的影响。2热敏脂质体的制备工艺考察以天然卵磷脂作为热敏脂质体的制备材料,通过正交试验对影响脂质体相变温度的因素进行筛选,可以得到热敏性较好的脂质体。3磁性脂质体制备工艺研究对磁性Fe304使用油酸钠进行表面改性,可以提高磁粉的亲油性,使得磁粉更好的结合到脂质体的表面,形成稳定的磁性脂质体混悬体系,在外加磁场的引导下,可聚集于肿瘤部位。4HCPT磁性热敏脂质体体外药效学考察研究HCPT各剂型的细胞毒性试验,由于HCPT闭环结构的抗肿瘤活性较开环结构强,脂质体能保护HCPT的内酯环结构包封于内部,在试验中可以看到HCPT磁性热敏脂质体组比较HCPT注射液组,在相同浓度条件下,前者对肿瘤细胞的抑制率比后者大,证明结果与理论相符。5HCPT磁性热敏脂质体联用聚焦超声抗肿瘤研究研究化疗联用HIFU治疗肿瘤试验,由于HIFU临床上针对的使用个体是人,而实验使用的是小鼠,由于试验个体大小差异悬殊,影响到对肿瘤的定位,以致无法确定治疗区域以及治疗剂量,最终导致治疗效果不明显,甚至出现实验组中途死亡,为此只有对治疗区域进行准确定位及确定HIFU使用的能量,才能达到良好的治疗效果。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 文献综述
• 实验研究
• 第一章 羟基喜树碱HPLC分析方法建立
• 1 前言
• 2 仪器和试剂
• 3 方法和结果
• 4 小结
• 5 讨论
• 第二章 羟基喜树碱磁性热敏脂质体的制备
• 第一节 正交试验优化羟基喜树碱脂质体制备工艺
• 1 前言
• 2 仪器和试剂
• 3 方法和结果
• 4 小结
• 5 讨论
• 第二节 天然大豆磷脂制备热敏脂质体的方法及质量评价
• 1 前言
• 2 仪器和试剂
• 3 方法和结果
• 4 小结
• 5 讨论
• 第三节 羟基喜树碱磁性脂质体制备工艺探索
• 1 前言
• 2 仪器与试剂
• 3 方法和结果
• 4 小结
• 5 讨论
• 第四节 羟基喜树碱磁性热敏脂质体的制备及质量评价
• 1 前言
• 2 仪器和试剂
• 3 方法和结果
• 4 小结
• 5 讨论
• 第三章 羟基喜树碱磁性热敏脂质体的体外抗肿瘤活性试验
• 1 前言
• 2 仪器、试剂和细胞
• 3 方法和结果
• 4 小结
• 5 讨论
• 第四章 羟基喜树碱磁性热敏脂质体联合HIFU体内抗肿瘤试验
• 1 前言
• 2 仪器、试剂和实验动物
• 3 方法和结果
• 4 小结
• 5 讨论
• 参考文献
• 结语
• 在学期间发表论文情况
• 附录
• 致谢