论文摘要
基因在表达翻译后形成蛋白质,其氨基酸序列不再是其功能的唯一决定因素,翻译后修饰在蛋白质结构功能成熟过程中发挥重要的调节作用。在应对外界环境因素作用下,细胞内大量的蛋白质的功能实现是通过动态的翻译后修饰来完成的。翻译后修饰的作用赋予蛋白质更加丰富信息,现已知的翻译后修饰有上百种,研究蛋白质翻译后修饰对于阐明蛋白质在维持机体正常生理过程以及预防治疗相关疾病具有重要意义。本论文中我们研究了Trihydrophobin1的酪氨酸磷酸化在MAPK/ERK信号转导中的效应以及核受体FXR的乙酰化在酒精性脂肪肝中的作用,初步阐明翻译后修饰在细胞正常生理过程中的复杂调控机制以及进行疾病模型中的转化研究。第一部分Trihydrophobin1的酪氨酸磷酸化调控研究。c-Src是一种非受体型酪氨酸激酶,在细胞增殖、存活、黏附、形态形成以及细胞迁移中都发挥关键作用。在细胞内c-Src持续活化促进细胞增殖和迁移。原癌基因c-Src的同源蛋白,v-Src,它为持续活化的激酶,并能导致肿瘤形成。已经在人类多种癌症中发现的c-Src高表达及激酶活性增高。Trihydrophobin1（TH1）基因从果蝇到人类的种属间都是高度保守,在心肌、骨骼肌、肾脏、肾上腺以及甲状腺等多种组织中广泛表达。TH1蛋白能够特异性的与MAPK/ERK信号通路的分子A-Raf相互作用,并且抑制A-Raf蛋白的激酶活性,此外,TH1还能与和PAK1相互作用对其激酶活性负调节,并且能够抑制MAPK/ERK信号传导及细胞迁移过程。TH1在乳腺癌中低表达,其表达水平与乳腺癌恶性程度成负相关,推断TH1可能是一个抑癌基因。尽管我们对TH1功能的理解已经发展,但对TH1本身的功能调节还知之甚少。本课题中,我们通过免疫共沉淀,GST-pull down的方法鉴定了c-Src与TH1在细胞内和体外均存在相互作用,这种相互作用依赖于c-Src的活化后结构开放状态。并且内源性的c-Src与TH1也存在相互作用。通过激光共聚焦技术,我们观察到细胞内源性的c-Src与TH1在胞质内存在共定位。在细胞内及体外实验中,我们又发现c-Src能够磷酸化TH1,其酪氨酸磷酸化依赖于c-Src的激酶活性,采用c-Src的特异性抑制剂PP2几乎完全阻断了TH1酪氨酸磷酸化。通过缺失突变、点突变和生物信息学方法,我们鉴定了磷酸化位点位于TH1的第6位酪氨酸。磷酸化的TH1与A-Raf及PAK1的相互作用能力降低,进一步的实验中我们发现TH1第6位酪氨酸的磷酸化减弱其对MAPK/ERK信号转导的抑制作用,对c-Src驱动的细胞迁移的抑制作用也减弱了。TH1非磷酸化的突变体TH1（TH1-Y6F）依然能够抑制MAPK/ERK信号转导及c-Src驱动的细胞迂移,TH1模拟持续磷酸化的突变体则几乎丧失了对MAPK/ERK信号转导的抑制作用以及对细胞迁移的抑制效果。此外,我们发现EGF及雌激素刺激情况下能够诱导细胞内源性的TH1酪氨酸磷酸化。综上所述,我们推断存在c-Src通过酪氨酸磷酸化TH1进而调控Ras/Raf/MEK/ERK信号转导及细胞迁移过程机制。第二部分核受体FXR及其乙酰化在小鼠酒精性脂肪肝中的作用及相关机制研究。核受体FXR对维持肝脏正常生理功能至关重要,在糖代谢、脂代谢、胆汁酸代谢的调控起到重要作用。研究发现,FXR缺失小鼠血糖、血脂、胆固醇异常升高。活化FXR能够在胆汁淤积性肝病、非酒精性脂肪肝、肝纤维化等慢性肝脏疾病中保护肝脏免受损伤。我们采用Lieber-DeCarli酒精液体饲料喂食小鼠构建酒精性脂肪肝模型,同时采用FXR缺失小鼠以及灌胃给予小鼠FXR激动剂WAY362450处理,研究FXR在小鼠酒精性脂肪肝进展中的作用。在酒精性脂肪肝小鼠中,我们首先检测肝脏胆汁酸含量及相关代谢运输基因表达水平,发现模型小鼠肝脏存在胆汁淤积,其胆汁酸含量较对照组显著增高（33.69±4.144μmoles/g liver vs.14.56±1.02μmoles/g liver,p<0.001）；胆汁酸合成限速酶CYP7A1表达量在酒精组小鼠肝脏中表达亦增高,它的表达受到FXR的负调控,胆汁酸盐输出蛋白BSEP的mRNA水平有一定程度降低,该基因受到FXR正调控。在两组小鼠肝脏内,FXR mRNA以及蛋白质水平并无明显差别,然而FXR与RXRα结合形成异二聚体的量明显减少,由于FXR发挥转录活性依赖于与RXRα的相互作用。此外在酒精性肝病小鼠中,FXR的乙酰化水平升高。FXR乙酰化会抑制其二聚化形成及转录活性,故我们推断在酒精性脂肪肝中FXR活性受到抑制。FXR缺失小鼠喂食酒精性饲料后,血清谷丙转氨酶活性较野生鼠高（111.01±15.94IU/L vs.71.48±6.83IU/L,p<0.05）,肝脏中甘油三酯含量也比野生鼠高（136.8±10.7mg/g livet vs.75.02±6.19mg/g liver,p<0.001）,肝脏HE染色显示肝细胞脂肪变性和气球样变性比野生多,油红O染色显示甘油三含量较野生鼠丰富。相反,给予FXR激动剂WAY-362450处理后,能够降低血清ALT水平（92.84±9.99IU/L vs.60.91±7.18IU/L,p<0.05）以及肝脏甘油三酯含量（110.6±7.011mg/g livet vs.57.71±8.08mg/g liver,p<0.001）,而FXR缺失小鼠体内给药WAY-362450并无此效应。肝脏HE染色和油红O染色均显示WAY-362450能够降低野生型小鼠肝脏脂肪变性程度。为了研究FXR治疗酒精性脂肪肝的机制,我们首先检测了酒精代谢相关基因的表达水平,CYP2E1受酒精刺激蛋白表达水平明显上升,其mRNA水平也明显上升,若同时给予WAY-362450灌胃治疗,小鼠肝脏CYP2E1蛋白和mRNA均明显下降,酒精代谢引起的脂质过氧化产物TBARS以及4-HNE含量增高也在FXR激活后受到抑制。小鼠原代肝细胞内CYP2E1水平能被FXR激动剂WAY-362450和GW4064抑制。我们的结果首次提出酒精代谢能够影响肝脏胆汁酸代谢造成胆汁淤积,为酒精性肝损伤的另一可能机制。我们推断FXR激动剂可以作为治疗酒精性脂肪肝的潜在药物。