健骨片促骨形成的实验研究

论文摘要

骨质疏松症是以骨量减少、骨组织显微结构退化为特征,以致骨的脆性增高及骨折危险性增加的一种全身骨病,是严重危害绝经后妇女健康的常见病、多发病,引起了全世界医学界的广泛注意。健骨片由江苏省中医药研究院骨科集多年治疗骨质疏松症的临床经验方精制而成,处方由骨碎补、淫羊藿、怀牛膝等中药组成,有补肾益精、强筋健骨、活血化瘀之功效。本实验通过建立大鼠拟绝经后骨质疏松症模型以及成骨细胞培养,观察健骨片对绝经后骨质疏松症的治疗作用及作用机理,以期阐明该药防治绝经后骨质疏松症的机理。主要研究内容和结果如下:1健骨片对去卵巢大鼠促进骨形成的防治作用及其作用机理:将SD雌性大鼠摘除双侧卵巢,常规喂养3个月制成拟绝经后骨质疏松症模型,再按17.6、8.8、4.4g生药/kg·d-1的剂量连续3个月灌胃给予健骨片（提取液）后,测定受试大鼠的骨密度（BMD）,血清中雌二醇（E2）、碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（BGP）、Ca2+、胰岛素样生长因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）等的含量及骨组织病理形态学检查,并与模型对照组和伪手术组进行比较。结果:健骨片各剂量组腰椎骨和股骨的骨密度比模型组有明显增加,血清中E2水平也明显增加,并能改善骨小梁形态,显著增加骨小梁平均宽度（WAT）与骨小梁面积百分比（TS%）,中低剂量还可明显降低血清BGP、ALP和Ca2+水平,并增加血清中胰岛素样生长因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）的含量。说明健骨片对去卵巢所致大鼠过高的骨转换具有明显的抑制作用,并能提高骨再建能力,具有明显的促进骨形成的作用。2成骨细胞的培养和鉴定:本实验用新生1～2d大鼠颅盖骨,采用二次酶消化法进行细胞体外培养。倒置显微镜观察细胞形态,对其碱性磷酸酶（ALP）活性及矿化能力进行鉴定。所培养得到的细胞具有体内成骨细胞的生物学行为。本实验原代培养成骨细胞的方法切实可行,为体外研究提供了一种客观而有效的实验手段。3健骨片原液对成骨细胞作用的研究:为了观察健骨片对体外培养新生大鼠颅骨成骨细胞增殖、分化、矿化的的影响,并探讨健骨片对TNF-α诱导凋亡的成骨细胞的影响,在成骨细胞细胞培养液中加入不同浓度的健骨片提取液共同培养,MTT法测定成骨细胞的增殖率和活性,对硝基苯酚法检测碱性磷酸酶（ALP）活性,茜素红染色方法观察矿化结节的形成。用TNF-α诱导成骨细胞凋亡,采用流式细胞仪观察健骨片提取液对大鼠成骨细胞凋亡的影响。实验结果表明,不同浓度的健骨片提取液直接加样,与成骨细胞共同培养后具有提高培养液中碱性磷酸酶活性的作用,但未发现对成骨细胞的增值矿化能力有明显影响,亦未发现有抑制细胞凋亡的作用。4健骨片含药血清对成骨细胞作用的研究:制备健骨片含药血清,观察其对成骨细胞增殖率、碱性磷酸酶活力、矿化结节的形成和细胞凋亡的影响。结果表明,健骨片含药血清未发现有刺激成骨细胞增殖作用,但具有提高碱性磷酸酶活性及矿化结节形成的数量的作用,还可能对TNF-α诱导的成骨细胞凋亡有部分保护作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 骨质疏松症的临床研究进展
• 1.1.1 骨质疏松症的分类
• 1.1.2 骨质疏松症发生的病因
• 1.1.3 西药防治骨质疏松症在临床上的研究
• 1.1.4 中药防治骨质疏松症在临床上的研究
• 1.2 骨质疏松症动物实验研究进展
• 1.2.1 造模动物的选择
• 1.2.2 常见的OP动物模型的制备
• 1.2.3 模型的判定指标
• 1.2.4 中药在骨质疏松动物实验研究中的应用
• 1.3 骨质疏松症成骨细胞实验研究进展
• 1.3.1 成骨细胞的来源
• 1.3.2 成骨细胞的体外分离及培养方法的研究进展
• 1.3.3 成骨细胞在骨代谢过程中的作用
• 1.3.4 中药在成骨细胞体外培养中的应用研究
• 1.4 本论文的研究目标及主要内容
• 1.4.1 研究目标
• 1.4.2 本论文主要内容
• 第二章 健骨片对去卵巢大鼠骨质疏松模型促骨形成的作用
• 2.1 主要实验材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 药物与试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 健骨片（提取液）的制备
• 2.2.1 绝经期大鼠模型的建立
• 2.2.2 分组及给药方法
• 2.3 指标检测
• 2.3.1 骨密度测定
• 2.3.2 生化指标测定
• 2.3.3 统计学分析
• 2.4 结果
• 2.4.1 对骨密度的影响
• 2.4.2 对血清学指标的影响
• 2.4.3 骨组织形态计量学观察
• 2.5 讨论
• 2.6 本章小结
• 第三章 成骨细胞的培养和鉴定
• 3.1 主要实验材料
• 3.1.1 实验动物
• 3.1.2 药物与试剂
• 3.1.3 主要仪器
• 3.2 成骨细胞原代培养及传代
• 3.2.1 成骨细胞原代培养操作步骤
• 3.2.2 细胞的传代与观察
• 3.3 成骨细胞鉴定
• 3.3.1 显微镜观察
• 3.3.2 碱性磷酸酶（ALP）染色
• 3.3.3 矿化结节染色
• 3.4 实验结果
• 3.4.1 显微镜下的观察
• 3.4.2 ALP染色的观察
• 3.4.3 矿化结节茜素红染色的观察
• 3.5 讨论
• 3.6 本章小结
• 第四章 健骨片药液对成骨细胞的作用研究
• 4.1 主要实验材料
• 4.1.1 实验动物
• 4.1.2 药物与试剂
• 4.1.3 主要仪器
• 4.2 健骨片药液的制备
• 4.3 观察指标
• 4.3.1 细胞增殖率的测定
• 4.3.2 碱性磷酸酶活力的测定
• 4.3.3 矿化结节计数
• 4.3.4 成骨细胞凋亡实验
• 4.3.5 统计学分析
• 4.4 实验结果
• 4.4.1 健骨片对成骨细胞增殖的影响
• 4.4.2 健骨片对成骨细胞ALP活力的影响
• 4.4.3 健骨片对成骨细胞形成矿化结节的影响
• 4.4.4 细胞凋亡实验
• 4.5 讨论
• 4.6 本章小结
• 第五章 健骨片含药血清对成骨细胞的作用研究
• 5.1 主要实验材料
• 5.1.1 实验动物
• 5.1.2 药物与试剂
• 5.1.3 主要仪器
• 5.2 含药血清的制备
• 5.3 观察指标
• 5.3.1 细胞增殖率的测定
• 5.3.2 碱性磷酸酶活力的测定
• 5.3.3 矿化结节计数
• 5.3.4 成骨细胞凋亡实验
• 5.3.5 统计学分析
• 5.4 实验结果
• 5.4.1 健骨片含药血清对成骨细胞增殖的影响
• 5.4.2 健骨片含药血清对成骨细胞ALP活力的影响
• 5.4.3 健骨片含药血清对成骨细胞形成矿化结节的影响
• 5.4.4 细胞凋亡实验
• 5.5 讨论
• 5.6 本章小结
• 第六章 总结与展望
• 6.1 主要结论
• 6.2 展望
• 参考文献
• 攻读硕士期间发表的论文
• 致谢