鸡胚生殖细胞减数分裂起始调控的研究

论文摘要

鸡胚常被用作发育生物学研究的动物模型,应用于深层次揭示动物发育的机理,尤其是生殖系统的发育,在实践中提高家禽的繁殖性能,在理论上阐明生殖细胞早期发育的调控机理。本实验以海兰鸡胚为材料,研究四个科学问题：①雌激素通过改变性腺的结构而影响生殖细胞性别发育的方向；②垂体-卵巢轴激素如何调控生殖细胞在有丝分裂和减数分裂起始之间的选择；③孕酮（P4）通过何种机制诱发生殖细胞减数分裂的起始；④碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）是否参与调节卵巢内生殖细胞的发育。1.雌激素对生殖细胞发育方向的影响哺乳动物和鸟类生殖细胞减数分裂起始存在性别间差异,雌性生殖细胞于胚胎期起始减数分裂而雄性生殖细胞在胚胎期增殖后进入滞育阶段。早期生殖细胞减数分裂起始被认为可由性腺的结构所决定,但缺少体内的证据来证明。本研究使用雌激素（E2）和芳香化酶抑制剂（AI）处理进行性别逆转,改变性腺结构检测生殖细胞性别决定因素。结果表明：E2或AI处理均可引起性腺形态逆转；处理后两性卵巢样皮质内生殖细胞进入减数分裂状态,而精索状结构中均未见此现象发生。推测出现上述现象原因是E2和AI处理后使得性腺内中视黄酸（RA）浓度发生了改变。编码RA主要降解酶基因(Cyp26b1的表达量出现了性别间差异。进一步使用免疫组化染色发现Cyp26b1主要在睾丸精索状结构中表达。综上所述：雌激素通过改变性腺结构影响生殖细胞减数分裂的起始时间,其中Cyp26bl的分布引起RA浓度差异是关键因素。2.垂体-卵巢轴激素调控生殖细胞有丝分裂与减数分裂的选择胚胎期卵巢生殖细胞发育面临两个重要事件：有丝分裂和起始减数分裂。本研究利用鸡胚为模型,研究垂体-卵巢轴激素在生殖细胞有丝分裂和减数分裂起始之间选择所发挥的调控作用。对鸡胚进行卵泡刺激素（FSH）和黄体生成素（LH）注射以改变体内促性腺激素的浓度,结果表明：FSH处理下调了减数分裂基因及其蛋白的表达并显著提高了增殖状态生殖细胞的比例；LH处理上调了减数分裂基因及其蛋白的表达,对生殖细胞的增殖无显著影响。结果还表明,miR181a*的转录受到促性腺激素的调控参与了垂体-卵巢轴对生殖细胞发育的调控。进一步研究发现,FSH和LH处理分别上调了类固醇激素合成酶Cyp19al和3βHSDII的转录。使用AI与FSH共同处理,发现AI可阻止FSH所发挥的作用。LH处理可增加卵巢中3βHSDII的转录,促进P4的合成,参与了减数分裂的起始。综上所述：鸡胚垂体-卵巢轴激素通过调节卵巢内类固醇激素的分泌,分别调节了生殖细胞增殖和减数分裂的起始。3.P4调控生殖细胞减数分裂起始最新研究表明,RA可能不是唯一的内源性引发减数分裂起始的因子。作者前期研究证实LH通过刺激P4合成诱发生殖细胞减数分裂的起始。在本研究中,雌性鸡胚注射P4可使生殖细胞提前起始减数分裂；体内P4处理对睾丸生精细胞没有显著影响,但P4刺激了体外培养的睾丸生殖细胞起始减数分裂。抑制RA受体不能阻止P4诱发的生殖细胞减数分裂起始,提示RA受体并没有介导该过程。此外,P4处理对RA主要的合成和代谢酶及RA受体mRNA的表达均无显著影响；使用高效液相色谱分析发现,P4处理并未改变卵巢内RA的浓度,这表明P4并非通过RA而发挥作用。利用鸡胚生殖细胞一体细胞共培养模型,使用siRNA敲减P4核受体PRA及PRB表达后,然后用P4处理仍可刺激生殖细胞进入减数分裂,提示P4的作用可能并非通过与核受体结合而发挥作用,确切的机制有待进一步研究。综上所述,本研究为鸡胚生殖细胞减数分裂起始机制提供了新的见解,P4可能是RA信号之外调节生殖细胞减数分裂起始的内分泌因子。4.bFGF调节鸡胚卵巢生殖细胞的发育在动物胚胎发育过程中,bFGF具有抑制细胞分化和促进增殖的作用。前期报道中鸡胚卵巢内部分生殖细胞没有起始减数分裂。本研究中使用体内和体外方法探索了bFGF在鸡胚卵巢生殖细胞的作用。结果表明：鸡胚卵巢bFGF随着减数分裂的进行,其表达从全卵巢表达转变为卵巢髓质表达；通过RT-PCR及原位杂交的方法,证实其受体在卵巢中均有表达；使用卵巢培养模型发现bFGF显著降低了RA促进减数分裂起始的作用,且与RA信号无关。此外,bFGF促进了生殖细胞保持未分化状态（SSEA阳性）并增殖。体内注射bFGF后出雏鸡卵巢皮质层厚度增加。综上,bFGF抑制了RA诱发的生殖细胞减数分裂起始,使胚胎卵巢生殖细胞保持未分化状态并进一步增殖。5.成年鸡卵巢生殖细胞再生的探索传统理论认为,雌性哺乳动物和鸟类出生（出壳）时只具备卵母细胞的有限储备池,失去了产生卵母细胞的能力。然而,最近的研究结果却与这一传统观点不符,认为动物卵巢内卵母细胞的数量并非固定,在某些条件下可以再生。前期的实验表明,bFGF可使卵巢中部分卵原细胞保持未分化状态。通过石蜡切片及免疫组化和RT-PCR检测发现：在胚胎期直至成年鸡卵巢中均发现生殖细胞样的细胞簇群,并在胞质中表达Dazl蛋白；检测到不同阶段成年鸡卵巢中均有减数分裂相关基因的表达。推测成年鸡卵巢中可能存在卵原细胞起始减数分裂过程。综上所述,本研究证实了RA调控胚胎期生殖细胞减数分裂起始的作用,这一过程受到性腺环境、垂体-卵巢轴及卵巢旁分泌、自分泌的调节。此外,P4具有独立于RA信号之外诱发生殖细胞减数分裂起始的作用。在此基础上,探索了成鸡卵巢是否具有生殖细胞再生现象。这些结果为阐明早期生殖细胞发生的调控机理及提高家禽繁殖性能奠定了的理论基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
• 1.1 减数分裂概况
• 1.1.1 减数分裂过程
• 1.1.2 卵子发生过程
• 1.1.3 精子的发生过程
• 1.2 生殖细胞减数分裂起始的调控
• 1.2.1 生殖细胞起始减数分裂的条件
• 1.2.2 RA起始减数分裂
• 1.2.3 调控减数分裂的其他因素
• 1.2.4 展望
• 1.3 鸡胚模型在生殖生理研究中的优势
• 1.3.1 易获取
• 1.3.2 体外发育,易于操作
• 1.3.3 内分泌研究时母体影响较小
• 1.3.4 转基因模型建立的优势
• 1.3.5 展望
• 1.4 本研究的目的和内容
• 1.4.1 研究的目的和意义
• 1.4.2 研究的目标和内容
• 第二章 雌激素对鸡胚性腺生殖细胞发育的影响
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验动物
• 2.2.2 主要器材
• 2.2.3 主要试剂及配制
• 2.2.4 胚胎处理及样品采集
• 2.2.5 性别鉴定
• 2.2.6 石蜡切片制作和形态学观察
• 2.2.7 免疫组织化学染色
• 2.2.8 冰冻切片免疫荧光染色
• 2.2.9 RNA提取
• 2.2.10 cDNA的合成
• 2.2.11 Real-time PCR
• 2.2.12 BrdU掺入鉴定生殖细胞的增殖
• 2.2.13 数据统计分析
• 2.3 结果
• 2.3.1 生殖细胞中的Dazl定位
• 2.3.2 雌激素处理后性腺的形态特征
• 2.3.3 卵巢皮质和卵巢样皮质内生殖细胞起始减数分裂
• 2.3.4 睾丸及睾丸精索状结构内生殖细胞保持有丝分裂状态
• 2.3.5 性腺内RA合成、代谢相关酶mRNA的表达变化
• 2.4 讨论
• 第三章 垂体-卵巢轴激素对卵巢生殖细胞发育的影响
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验动物
• 3.2.2 主要器材
• 3.2.3 主要试剂及配制
• 3.2.4 处理方法及组织收集
• 3.2.5 器官培养
• 3.2.6 RNA提取、cDNA合成及Real time PCR
• 3.2.7 Mi croRNA表达分析
• 3.2.8 免疫荧光共定位
• 3.2.9 BrdU掺入及检测
• 3.2.10 Western blot分析
• 3.2.11 统计分析
• 3.3 结果
• 3.3.1 FSH和LH调节生殖细胞减数分裂起始
• 3.3.2 FSH促进生殖细胞有丝分裂并延迟其减数分裂起始
• 3.3.3 促性腺激素调控miR181a及NR6A1 mRNA的转录
• 3.3.4 雌激素参与了FSH调节生殖细胞减数分裂及有丝分裂
• 4分泌调节减数分裂起始'>3.3.5 LH通过P₄分泌调节减数分裂起始
• 3.3.6 FSH在生殖细胞发育中启主导作用
• 3.4 讨论
• 第四章 孕酮在生殖细胞减数分裂起始中的作用
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 实验动物
• 4.2.2 主要器材
• 4.2.3 主要试剂及配制
• 4.2.4 处理方法及组织收集
• 4.2.5 器官培养
• 4.2.6 RNA提取,cDNA合成及Real time PCR
• 4.2.7 免疫荧光共定位
• 4.2.8 高效液相色谱分析
• 4.2.9 生殖细胞-体细胞共培养模型建立
• 4.2.10 RNA干扰
• 4.2.11 数据的统计分析
• 4.3 结果
• 4促进雌性生殖细胞减数分裂起始'>4.3.1 P₄促进雌性生殖细胞减数分裂起始
• 4促进体外雄性生殖细胞减数分裂起始'>4.3.2 P₄促进体外雄性生殖细胞减数分裂起始
• 4诱发减数分裂不依赖于PR'>4.3.3 P₄诱发减数分裂不依赖于PR
• 4促进生殖细胞减数分裂不依赖于RA'>4.3.4 P₄促进生殖细胞减数分裂不依赖于RA
• 4.4 讨论
• 第五章 碱性成纤维细胞生长因子对鸡胚卵巢生殖细胞发育的影响
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 实验动物
• 5.2.2 主要器材
• 5.2.3 主要试剂及配制方法
• 5.2.4 器官培养
• 5.2.5 鸡胚内注射bFGF
• 5.2.6 RNA提取、cDNA合成及Real-Time RT-PCR
• 5.2.7 FGFR1原位杂交
• 5.2.8 Giemsa染色检测生殖细胞减数分裂状态
• 5.2.9 免疫荧光染色
• 5.2.10 BrdU掺入检测生殖细胞的增殖
• 5.2.11 数据的统计分析
• 5.3 结果
• 5.3.1 bFGF及FGFR mRNA在卵巢发育过程中的表达情况
• 5.3.2 RA促进生殖细胞减数分裂起始
• 5.3.3 bFGF对RA引发的减数分裂起始的抑制作用
• 5.3.4 bFGF促进生殖细胞增殖
• 5.4 讨论
• 第六章 成鸡卵巢生殖细胞再生的探索
• 6.1 引言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 实验动物
• 6.2.2 主要器材
• 6.2.3 主要试剂及配制方法
• 6.2.4 RNA提取、cDNA合成及Real-Time RT-PCR
• 6.2.5 免疫荧光染色
• 6.3 结果
• 6.3.1 成鸡卵巢中原始生殖细胞的检测
• 6.3.2 成年鸡卵巢表达生殖细胞减数分裂起始相关基因
• 6.4 讨论
• 第七章 提示和创新点
• 参考文献
• 致谢
• 博士期间发表文章