福氏志贺菌F4cv和F4s新亚型的表型及基因型特性研究

论文摘要

志贺菌属根据O抗原不同,分为4群40余血清型:A群痢疾志贺菌（Shigella dysenteriae）;B群福氏志贺菌（Shigella flexneri）;C群鲍氏志贺菌（Shigella boydii）;D群宋内志贺菌（Shigella sonnei）在我国以B群福氏志贺菌流行为主,在某些地区福氏志贺菌感染可高达90%,而福氏志贺菌中以F2a F1a感染为主[1,2]世界各地相继报道一些志贺菌新的血清亚型F4c F1c F4x等[3,4,5],我国于2009年也鉴定出了一种新的亚型SFxv[6]本研究也从临床标本中鉴定出两种福氏志贺菌血清学非典型菌株共62株,他们的血清型与之前文献报道有所差异,暂命名为F4cv和F4s,针对这些菌株做进一步研究,包括新亚型的毒力基因多重耐药性遗传特点基因差异等特点进行分析具体研究内容包括以下几部分:首先对监测中分离到的血清学非典型菌株进行血清生化鉴定采用日本生研（Denka Seiken）血清和瑞典福氏志贺菌单克隆抗体血清（Monoclonal Antibodies for Shigella flexneri, MASF）进行血清学鉴定,结果为:生研血清反应式为F4cv: IV+, 7（8）+ F4s: IV+;MASF血清鉴定反应式为F4cv: B+, IV:I +, 7（8）+ F4s: B+, IV:I +与之前文献报道中的血清型反应均有差异,所以暂命名为F4cv和F4s采用法国梅里埃API 20E生化鉴定试剂盒进行生化鉴定试验,结果为F4cv和F4s均分解葡萄糖甘露醇蜜二糖阿拉伯糖,鉴定为志贺菌属Fxv除了分解葡萄糖发酵甘露醇蜜二糖阿拉伯糖之外,它的吲哚试验为阳性利用Kirby-Bauer琼脂法,选用14种抗生素药敏纸片,进行抗生素敏感试验结果为F4cv对萘啶酸的耐药率为100%,四环素耐药率为96.72%,氨苄西林耐药率为93.44%,氯霉素阿莫西林-克拉维酸和氨苄西林-舒巴坦耐药率均为91.80%,磺胺甲噁唑-甲氧苄啶耐药率为86.89%其中氨苄西林磺胺甲噁唑-甲氧苄啶为我国临床痢疾治疗常用的一线药物而且对目前临床治疗首选的第三代喹诺酮类抗生素诺氟沙星的耐药性高达68.85%,高于国内外文献报道对环丙沙星的耐药性为19.67%,对第四代喹诺酮类抗生素左氧氟沙星耐药性为18.03%对第三代头孢菌素头孢他啶和头孢噻肟也出现耐药株值得引起关注的是有3株F4cv同时对诺氟沙星和第三代头孢菌素耐药F4s耐药谱与F4cv相似Fxv对诺氟沙星环丙沙星磺胺甲噁唑-甲氧苄啶敏感性较高而F4cv对这三种抗生素的敏感性相对较低,其中F4cv对诺氟沙星的耐药率为68.85%通过分析以上结果,发现所有F4cv属于多重耐药菌株,且对临床治疗首选药物耐药性增强,其耐药谱更加广泛,且多重耐药情况复杂,给临床治疗和疾病防控增加困难用PCR方法对这些菌株进行毒力基因ipaH ial sen set1A set1B virF检测结果显示F4s缺失ial毒力基因61株F4cv全部携带set1A set1B和ipaH基因,sen ial virF基因携带率分别是83.61% 83.61% 75.41% F4cv毒力基因的携带模式可以分为6种其中有37株6个毒力基因全部携带,占所有菌株一半以上（60.66%）,为优势毒力基因型说明这些菌株可能具有较强毒力,可能成为细菌性痢疾流行的优势菌株,是痢疾的暴发潜在危险因素采用试剂盒提取细菌质粒DNA,并用琼脂糖凝胶电泳检测结果,可以得到质粒图谱61株F4cv菌株分为多个质粒图谱型,其中33株（54.10%）含有20kb的质粒,57株（93.44%）含有10.5kb的质粒32株（52.46%）含有8.7kb的质粒,56（91.80%）株含有4.8 kb的质粒,59株（96.72%）含有3.9kb的质粒, 54株（88.52%）含有3.5kb的质粒,60株（98.36%）含有2.2kb和1.8kb的质粒F4s菌株含有的质粒大小为10.5kb 4.8 kb 3.9kb 2.2kb和1.8kb,缺失20kb 8.7kb 3.5kb的质粒,这种图谱型与两株F4cv菌株相同Fxv缺失大小为8.7kb 3.5kb的质粒采用BioNumerics软件进行分析,结果显示:F4s单独一型,并且与两株F4cv菌株带型相同,说明他们携带的质粒相同,亲缘关系密切相似度为90%时,F4cv与Fxv属于同一聚类F4s F4cv Fxv Fx血清型菌株的质粒图谱均有差异但是聚类分析表明他们相互之间亲缘关系较近采用国际食源性监测网络PulseNet推荐的PFGE标准方法对其进行基因分型分析通过对XbaI和NotI两种限制性内切酶进行PFGE,最终选择NotI限制性内切酶对菌株进行酶切电泳通过分析电泳图谱,F4s F4cv Fxv之间相差1-3个条带,说明三者之间亲缘关系较密切BioNumerics软件对电泳图谱进行聚类分析聚类相似性为92%时,可将三种志贺菌分为27个带型,7个聚类群,分别为A-G聚类可以将其中61株F4cv菌株分为25个带型,7个聚类,表现出遗传多样性F4s为一单独带型在相似性容许度为96%时,F4s与F4cv属于B聚类群的同一个亚类,说明他们的亲缘关系比较接近,F4s可能由F4cv进化形成此时,Fxv与F4cv属于A聚类群的一个亚类,F4cv可能由Fxv演化而来根据EcMLST网站（http://www.shigatox.net/mlst）数据库提供的15个管家基因位点进行PCR扩增,对各管家基因PCR产物进行碱基序列测定,与EcMLST数据库中序列进行对比,得到各菌株相应的序列型（sequence type, ST） 61株F4cv及F4s均属于一个新的序列型ST100与数据库中其他序列型比较发现与ST18ST86只有一个位点差异,亲缘关系较近BioNumerics软件构建系统发生图可见,ST100所在的克隆群10是从出血性大肠杆菌所在的克隆群14分支进化而来MLST和PFGE分析结果显示MLST的分型能力要明显低于PFGE,PFGE在对同一血清型菌株的分辨力要远远高于MLST通过PCR技术,对文献中提供的可变数目串联重复序列（VNTR）位点进行筛选,得到多态性较好的5个VNTR位点SF3 SF6 SF11 SF12 SF34结合PCR产物测序电泳图谱,利用BioNumerics软件,对其多态性进行分析MLVA可将67株福氏志贺菌分为45个型,其中61株F4cv可分为43个型F4s单独一型,Fxv单独一型最小生成树显示F4s与Fxv分别位于两个群的不同分支上,但都是由F4cv分支而来,说明他们在基因型上与F4cv存在差别,但是又有远近不等的遗传进化关系F4cv各个菌株之间亲缘关系也呈现远近不等,说明他们之间也存在不同程度的变异通过以上分析,血清型将F4cv和F4s鉴定为新的血清亚型,两者具有相同的生化特点和相似的耐药情况与Fxv比较,F4cv耐药性增强,且出现强耐药菌株经PFGE MLST MLVA等方法进行基因型分析,可以认为F4s F4cvFxv之间亲缘关系较密切,F4s F4cv有可能都是从Fxv进化而来福氏志贺菌新亚型的出现容易引起流行暴发,以及对临床一线抗生素耐药性增强,这些问题给细菌性痢疾的防控带来挑战本研究针对这些问题所做的表型和基因型的分析,为解决治疗和防控问题提供了理论依据

论文目录

• 缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 志贺菌血清学鉴定及生化特性鉴定
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第二部分 抗生素敏感实验
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第三部分 毒力基因检测
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第四部分 质粒图谱分析
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第五部分 脉冲场凝胶电泳分型分析
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第六部分 多位点序列分型分析
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第七部分 多位点可变数量串联重复序列分析
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 结论
• 附录
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 论著
• 个人简历
• 致谢