农药多簇人工抗原的免疫特异性及多残留免疫金技术

论文摘要

本研究首先合成了四种农药的半抗原:三唑磷半抗原THHe、克百威半抗原BFNB、毒死蜱半抗原CHBu以及甲基对硫磷半抗原MP5。为制备出能够识别多种农药的“宽谱”特异性抗体,在人工抗原的制备上采用了一种全新的思路:采用碳二亚胺法,在同一载体蛋白上,依次偶联了4种不同的半抗原,在国内外首次制备得到了含有多种抗原决定簇的农药“多簇”人工抗原。通过将多簇人工抗原单独或混合免疫的方式获得了对应能够同时识别相应农药的高效价的宽谱特异性多克隆抗体,这为农药等小分子化合物多残留免疫快速测定技术研究开辟了一条新的途径。采用间接竞争ELISA法分别测试BSA宽谱多抗（即免疫原为BSA多簇人工抗原,下同）、HSA宽谱多抗、KLH宽谱多抗和BSA&KLH宽谱多抗对相应农药的亲合性,对克百威、三唑磷、毒死蜱、甲基对硫磷这4种农药的I10范围分别为:0.0024-0.0451μg/mL、0.0001-0.0013μg/mL、0.0062-0.0516μg/mL、0.0019-0.0211μg/mL;I50范围分别为0.0617-1.2208μg/mL、0.0242-0.1388μg/mL、0.4567-30.6194μg/mL、0.1156-7.5054μg/mL。将4种半抗原分别与载体蛋白偶联制备“单簇”抗原,再将单簇抗原混合免疫实验动物,同样获得了高效价的宽谱特异性多克隆抗体,但使用直接或间接竞争ELISA测试由混合单簇抗原免疫所得宽谱抗体对农药的亲合性,未检测出农药对抗原-抗体反应有明显的抑制作用。采用多簇抗原免疫实验动物制备单克隆抗体未获得成功,由单簇抗原分别免疫小鼠,成功制备出针对三唑磷、克百威、毒死蜱和甲基对硫磷的高特异性单抗,腹水效价均＞105,其I10分别为:0.0207、0.2325、0.7556和0.4004ng/mL;I50分别为0.1356、3.4086、8.3890和3.2045 ng/mL。选择金免疫层析法作为实现农药多残留检测的技术手段。采用柠檬酸三钠还原法制备理论粒径为25nm的胶体金颗粒。使用所制备的宽谱多抗、高特异性单抗、双单抗（本所制备）,OVA-半抗原偶连物分别制备金探针。经过一系列的工作条件优化,采用多膜复合以及单膜多元受体固定的方式,在国内外农药残留检测领域首次开发出了能同时检测三唑磷和克百威的多残留金标试纸条。以单抗为金探针的试纸条对三唑磷和克百威的检测限分别为0.004μg/mL、0.031μg/mL,以双单抗为金探针的试纸条对三唑磷和克百威的检测限分别为0.008μg/mL和0.063μg/mL。

论文目录

• 目录
• 致谢
• 术语和缩略语表
• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
• 1 开展农药多残留快速测定技术研究的必要性
• 1.1 影响食品质量安全的主要因素
• 1.2 目前我国食品质量安全的严峻形势
• 1.3 食品质量安全问题已经引起了国际社会和我国政府的高度重视
• 1.4 我国食品安全中的科技"瓶颈"制约
• 1.5 开展农药多残留快速测定技术研究的意义
• 2 农药多残留测定技术及其发展趋势
• 2.1 农药多残留仪器测定技术及其研究进展
• 2.1.1 样品前处理方法
• 2.1.2 检测技术
• 2.2 活体生物测定法在农药多残留检测中的应用研究及其进展
• 2.2.1 用家蝇检测蔬菜中的残留农药
• 2.2.2 用大型水蚤为试验材料监测蔬菜中农药的残留
• 2.2.3 用发光细菌检测农药残留
• 2.3 酶抑制测定方法
• 2.3.1 胆碱酯酶（ChE）抑制法
• 2.3.2 植物酯酶（Phytoesterase）抑制法
• 2.3.3 有机磷水解（Organophosphate hydrolase,OPH）法
• 2.4 农药多残留免疫快速测定技术及其研究进展
• 2.4.1 半抗原结构设计与合成
• 2.4.2 人工抗原的制备
• 2.4.3 抗体的制备及应用
• 2.4.4 免疫分析方法
• 3 选题依据
• 3.1 本课题得到了国家自然科学基金的资助
• 3.2 开展农药多残留免疫快速测定技术研究,本研究所具有扎实的研究基础
• 第2章 多簇抗原的制备及其宽谱抗体的免疫应答
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 试剂与药品
• 1.1.2 缓冲液
• 1.1.3 仪器与材料
• 1.1.4 实验动物的选择
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 半抗原合成
• 1.2.2 多簇人工抗原（免疫原）的制备与鉴定
• 1.2.3 半抗原-载体蛋白偶连物（单簇人工抗原）的合成与鉴定
• 1.2.4 混合单簇人工抗原的制备
• 1.2.5 宽谱特异性多兑隆抗体的制备
• 1.2.6 宽谱特异性单克隆抗体的制备
• 1.2.7 高特异性单克隆抗体的制备
• 1.2.8 碳二亚胺法合成酶标半抗原
• 1.2.9 ELISA方法的建立
• 2 结果
• 2.1 半抗原分子的结构鉴定
• 2.1.1 毒死蜱半抗原（CHBu）的结构鉴定
• 2.1.2 三唑磷半抗原（THBu& THHe）的结构鉴定
• 2.1.3 克百威半抗原（BFNB）的结构鉴定
• 2.1.4 甲基对硫磷半抗原（MP5）的结构鉴定
• 2.2 多簇人工抗原（免疫原）结合比测定
• 2.2.1 BSA多簇抗原的结合比测定
• 2.2.2 HSA多簇抗原的结合比测定
• 2.2.3 KLH多簇抗原的结合比测定
• 2.3 人工抗原的合成与鉴定
• 2.4 宽谱多克隆抗血清效价测定
• 2.5 宽谱单克隆抗体的制备
• 2.6 四种高特异性单克隆抗体的制备
• 2.7 抗原-宽谱多抗最适工作浓度的筛选
• 2.8 宽谱多抗亲和性及检测灵敏度
• 2.8.1 直接竞争法
• 2.8.2 间接竞争法
• 2.9 四种单抗的亲和性和检测灵敏度
• 2.10 宽谱多克隆抗体的特异性
• 3 小结与讨论
• 3.1 小结
• 3.2 讨论
• 第3章 农药多残留检测金标试纸条研制
• 1 材料与方法
• 1.1 试剂与仪器
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 胶体金的制备
• 1.2.2 金探针的制备
• 1.2.3 金标试纸条的组装和制备材料的选择与处理
• 1.2.4 多残留检测金标试纸条的研制
• 1.2.5 金标试纸条检测结果的判断
• 1.2.6 金标试级条灵敏度测试
• 1.2.7 溶液pH值对试纸条检测的影响测试
• 1.2.8 总离子浓度对试纸条检测的影响测试
• 1.2.9 添加样品实验
• 2 结果
• 2.1 胶体金的制备与鉴定
• 2.2 胶体金标记蛋白最适pH值的确定
• 2.3 最适蛋白结合量测定
• 2.4 金探针溶液稳定剂配方筛选
• 2.5 浓缩液配方筛选结果
• 2.6 金标试纸条制备材料的选择和处理
• 2.6.1 NC膜的选择
• 2.6.2 结合垫的处理
• 2.6.3 工作浓度的优化
• 2.6.4 NC膜的封闭配方筛选
• 2.7 多残留检测金标试纸条的研制
• 2.7.1 单个农药品种试纸的开发
• 2.7.2 多条检测线试纸条的开发
• 2.7.3 利用宽谱多克隆抗体开发多残留检测金标试纸条
• 2.8 溶液pH值对试纸条检测的影响测试
• 2.9 总离子浓度对试纸条检测的影响测试
• 2.10 样品检测
• 3 小结与讨论
• 3.1 小结
• 3.2 讨论
• 3.2.1 胶体金溶液的制备
• 3.2.2 胶体金标记抗体
• 3.2.3 试纸条保护剂筛选
• 第4章 农药多残留免疫速测技术研究思路之比较
• 1 几种研究思路之比较
• 1.1 共性结构半抗原设计思路
• 1.2 多簇人工抗原设计思路
• 1.3 抗体制备技术思路
• 1.4 标记模式与信号检测思路
• 2 不足与展望
• 参考文献
• 附录