论文摘要
目的构建野生型DJ-1、A39S突变型DJ-1以及缺失SUMO-1互作氨基酸（K130）的K130R突变型DJ-1真核表达质粒（pEGFP-N1-DJ-1-WT、pEGFP-N1-DJ-1-A39S、pEGFP-N1-DJ-1-K130R）；探讨DJ-1基因致病突变A39S以及DJ-1的SUMO化修饰对DJ-1蛋白线粒体亚细胞定位的影响。方法将pCDNA3.1-Myc-His（-）B-DJ-1-WT、pCDNA3.1-Myc-His（-）B-DJ-1-A39S、pGEX-5x-1-DJ-1-K130R真核表达质粒分别双酶切后连接、亚克隆至pEGFP-N1载体上，利用脂质体介导转染方式将构建好的质粒转入COS-7细胞中；通过western印迹、免疫荧光和激光共聚焦等技术检测相应的蛋白质表达；再用线粒体染色剂与免疫荧光技术进一步研究DJ-1基因A39S致病突变以及DJ-1的SUMO化修饰对DJ-1蛋白线粒体亚细胞定位的影响。结果构建所得pEGFP-N1-DJ-1-WT、pEGFP-N1-DJ-1-A39S、pEGFP-N1-DJ-1-K130R真核表达质粒经双酶切鉴定及DNA测序证实；Western印迹结果显示构建所得的真核表达质粒均能正确表达目的EGFP-DJ-1融合蛋白（52KD）；免疫荧光结果显示野生型、A39S突变型、K130R突变型DJ-1蛋白均广泛分布于细胞质和细胞核中，以细胞质分布为主；野生型、A39S突变型、K130R突变型DJ-1均与线粒体存在共定位，A39S突变型、K130R突变型DJ-1对DJ-1蛋白的线粒体亚细胞定位无明显影响。结论1、构建了能在哺乳动物细胞中有效表达野生型DJ-1、A39S突变型DJ-1、K130R突变型DJ-1的pEGFP-N1真核表达质粒；2、DJ-1基因致病突变A39S对DJ-1蛋白的线粒体亚细胞定位无明显影响；SUMO-1修饰对DJ-1蛋白的线粒体亚细胞定位也无明显影响。